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摘 要

海藻糖水解酶是一类可以将海藻糖分解成两分子葡萄糖的酶，属于糖苷水解酶类。该酶广泛存在于细菌和真核中，其在当代工业、医学方面有重要作用。根据各种反应的最适pH或调节性，可以将海藻糖水解酶分为中性和酸性海藻糖酶或调节性和非调节性海藻糖酶。

本实验研究C .kristjanssonii来源海藻糖水解酶的克隆表达，成功构建了带有TreA基因的重组表达质粒；将重组质粒导入表达宿主中，并诱导其表达，重组菌经过 SDS-PAGE 验证后，能看出明显的蛋白表达条带。研究该酶的酶学性质结果表明该酶最适 pH值是4.0，在偏酸性条件下稳定性更好；最适温度为60℃，酶液放置于30-60℃下2 h，酶活可保持在75%左右；Na 、Mg² 、Co² 、Cu² 、Fe³ 对酶活有抑制作用，Ca² 、Mn² 对酶活有促进作用，其余金属离子则对该酶几乎无影响。

关键词：海藻糖水解酶 克隆表达 重组 酶学性质

Cloning and expression of Caldicellulosiruptor kristjanssonii - derived trehalose hydrolase

ABSTRACT

Trehalose hydrolase is a kind of enzyme which can decompose trehalose into two glucose molecules. The enzyme is widely found in bacteria and eukaryotes and plays an important role in modern industry and medicine.Trehalose hydrolases can be divided into neutral and acidic trehalose enzymes or regulatory and non-regulatory trehalose enzymes according to the optimal pH or regulatory of various reactions.

In this experiment, the cloning and expression of C .kristjanssonii derived trehalose hydrolase was studied, and the recombinant expression plasmid with TreA gene was successfully constructed.The recombinant plasmid was introduced into the expression host and induced to express. After sds-page verification, the recombinant bacteria showed obvious protein expression bands. Studies on the enzyme properties of trehalose hydrolase showed that the optimum pH of the enzyme was 4.0, and the enzyme had good stability under acidic conditions.Optimum temperature was 60 ℃, enzyme fluid placed under 30-60 ℃ for 2 h, enzyme activity can maintain at 75%;Na , Mg² , Co² , Cu² and Fe³ inhibited the enzyme activity, Ca² and Mn² promoted the enzyme activity, while other metal ions have little effect on enzyme activity.

Keywords: trehalose hydrolase clone expression recombinant enzymatic properties

目录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章文献综述 1

1.1海藻糖水解酶的简介 1

1.2海藻糖水解酶的分类 1

1.3海藻糖水解酶的作用机理 2

1.4海藻糖水解酶的应用和前景 3

1.5本课题的研究内容 3

第二章 材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1实验仪器 5

2.1.2实验试剂 6

2.1.3菌株和质粒 7

2.1.4培养基 7

2.2培养方法 8

2.2.1.菌种活化 8

2.2.2种子培养 8

2.2.3.转接 9

2.2.4.TB诱导表达 9

2.3 克隆表达的实验方法 9

2.3.1目的基因的获取 9

2.3.2重组质粒的构建 10

2.3.3重组蛋白的诱导表达 11

2.3.4重组蛋白的纯化 14

2.3.5重组蛋白的酶活检测 14

2.4海藻糖水解酶的酶学性质研究 15

2.4.1重组蛋白的最适pH研究 15

2.4.2重组蛋白的最适反应温度和温度稳定性研究 15

2.4.3金属离子对海藻糖水解酶活性的影响 15

第三章 结果与讨论 16

3.1重组质粒的构建和筛选 16

3.1.1目的基因的获取 16

3.1.2载体和目的基因双酶切 16

3.1.3重组蛋白PET22b-CkTreA的表达与纯化 18

3.2重组蛋白的酶学性质研究 18

3.2.1 pH对海藻糖水解酶的影响 18

3.2.2温度对海藻糖水解酶的影响 19

3.2.3金属离子对海藻糖水解酶的影响 21

第四章 结论与展望 23

4.1结论 23

4.2展望 24

参考文献 25

致谢 29

第一章文献综述

1.1海藻糖水解酶的简介

糖苷水解酶是一类能水解碳水化合物中糖苷键的酶类，其在再生能源、食品工业以及具有医疗价值的低聚寡糖生产等方面有广泛的应用前景，因此人们正在致力于寻找具有高活力并且性质优良的糖苷水解酶类[1-4]。随着现代生物学的发展，微生物的基因组序列得以被测定，利用分子生物学方法直接对糖苷水解酶基因进行克隆和表达成为大量筛选糖苷酶的有效方法。

海藻糖水解酶是可以将海藻糖分解成两分子葡萄糖的酶，属于水解酶类, 且底物作用是高度专一的，并且它存在于细菌和真核中。1893年首次由Bourquelot鉴定黑曲霉中分离出来海藻糖水解酶[7]，有研究表明在几个哺乳动物包括人类的小肠中分离出海藻糖水解酶[8]。

1.2海藻糖水解酶的分类

海藻糖水解酶按主要结构分为两组:大多数海藻糖酶的糖苷水解酶家族GH37，部分酸性海藻糖酶和磷酸化酶的家族GH65（碳水化合物活性酶数据库）[5]。依据反应的最适pH可将海藻糖水解酶分为中性和酸性海藻糖水解酶。这两种酶定位在不同的亚细胞中，其生化参数不同，具体的功能也不尽相同，在很多真菌（例如酵母）和其他物种内都有它们的存在[9-12]。

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