论文总字数：26370字

摘 要

为引导代谢途径更多的流向目标产物，可利用基因工程方法构建L-苹果酸重组菌株。在大肠杆菌AFP111中利用CRISPR/Cas9的技术敲除NAD(H)合成途径上的关键基因nadC再三阶段合成L-苹果酸，结果表明，苹果酸的溢出提高可能是因为nadC缺失能够有效降低胞内NAD 的总量，使得苹果酸到草酰乙酸的代谢速率受到限制。经三阶段发酵后，重组菌株AFP111△nadC消耗33.57 g/L的丁二酸，最多产20.41 g/L的苹果酸和2.60 g/L的富马酸，转化率达到56.4%。

关键词：基因敲除 苹果酸溢出 三阶段合成

Effect of nadC gene deletion on the synthesis of recombinant Escherichia coli L-malic acid

Abstract

To direct the metabolic flux flowing more to the target product,we can construct the L-malic acid producing bacteria by genetic engineering,In the E. coli AFP111, the key gene nadC gene on the NAD(H) synthesis pathway was knocked out in E. coli AFP111 to synthesize L-malic acid. The results showed that the nadC deletion can reduce the synthesis of NAD(H) and reduce the cell effectively. The total amount of NAD in the cell limits the metabolic rate of malic acid to oxaloacetate, thereby increasing the overflow of malic acid. After three-stage fermentation, the recombinant strain AFP111△nadC consumed 33.57g/L of succinic acid, producing up to 20.41g/L of malic acid and 2.60g/L of fumaric acid, and the synthesis rate reached 56.4%.

Key words: gene knockout; malic acid spillover; three-stage synthesis

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 L-苹果酸合成 1

1.3 L-苹果酸溢出代谢 3

1.4构建nadC基因缺失菌株 3

1.5本论文的研究内容和目的 4

第二章 敲除nadC基因 5

2.1 前言 5

2.2 材料与方法 6

2.2.1实验菌株 6

2.2.2 分子改造所用试剂 7

2.2.3 实验试剂 8

2.2.4 实验仪器 9

2.2.5 培养基 10

2.2.6 构建重组质粒 14

2.3 结果与讨论 17

2.4 本章小结 19

第三章 三阶段发酵产L-苹果酸 20

3.1前言 20

3.2 材料与方法 21

3.2.1 实验菌株 21

3.2.2 实验试剂 22

3.2.3 实验仪器 23

3.2.4 培养基 23

3.2.5培养方式 24

3.2.6分析检测方法 24

3.3 结果与讨论 25

3.4 本章小结 27

第四章 结论与展望 28

4.1 结论 28

4.2 展望 28

参考文献 30

致谢 32

第一章 文献综述

1.1 前言

L-苹果酸是一种天然有机酸，在自然界中分布广泛，并且作为重要的中间代谢物参与TCA 循环，被广泛应用于化工、医药和食品等领域^[1], 工业价值高。目前主要有三种生产方法，即酶催化法、化学合成法和微生物发酵法^[2]，其中微生物发酵法应用前景最为广阔，具有原料来源广、工艺条件温和、产品质量稳定以及生产成本低等优势，因此成为近年来的研究热点。

Battat等首次发现黄曲霉（Aspergillus f lavus）可以利用糖质原料直接发酵生产L-苹果酸，并优化了发酵条件后， 使得L-苹果酸产量达到113 g/L，产率达到1.26 mol/mol葡萄糖^[3]。但是由于该菌株在发酵过程中会产生黄曲霉毒素使其广泛应用受到了限制。除了黄曲霉外，黑曲霉（Aspergillus niger）ATCC10577 ^[4] 和米曲霉（Aspergillus oryzae）NRRL3488 ^[5]也可以生产17 g/L和30.27 g/L L-苹果酸。此外，利用酵母属中的耐糖鲁氏酵母（Zygosaccharmyces rouxxi）^[6]也能获得大量L-苹果酸，产量为74.9 g/L、糖酸转化率为32.8%。遗憾的是，野生型菌株由于存在发酵周期长、发酵条件难以控制以及霉菌的菌丝易结球等缺点，限制了其在工业上的广泛应用。

为消除反应过程中副产物的生成，促进代谢合成，将L-苹果酸生产菌通过基因工程的方法进行改造，以期获得更多的目标产物。由于大肠杆菌的遗传结构清楚，代谢调控的手段方便，因此可将基因敲除技术和代谢工程手段结合对其改造，使副产物的合成途径受到限制，消除副产物的影响，从而提高 L-苹果酸的产量和转化率，目前已有国内外研究者成功改造大肠杆菌并用于生产乳酸、琥珀酸等，因此可被用于构建 L-苹果酸生产菌^[7]。

1.2 L-苹果酸合成

吴亚斌等^[8]对丙酮酸代谢过程的相关副产物合成途径进行限制以实现丙酮酸的积累，为L-苹果酸合成提供前体，接着将体外转化方法和蛋白质工程技术进行结合获得了苹果酸酶，构建了丙酮酸向L-苹果酸的一步转化路径，最后通过阻断L-苹果酸代谢流向以及优化胞内辅因子使得大幅度提高了L-苹果酸的产量。这一结果证明了利用代谢途径生产L-苹果酸的可行性，为改造E.coli生产L-苹果酸提供了新的研究思路。

有氧条件下，L-苹果酸作为三羧酸循环（TCA）中一个重要的中间代谢物，会很快代谢转化为草酰乙酸而被消耗，因此培养基中并没有苹果酸积累。在研究琥珀酸的生物合成过程中，利用重组大肠杆菌发酵制备琥珀酸，其最终浓度gt;100 g/L，生产速率gt; 2 g/L/h，收率gt; 95%。但在发酵过程中，将不断积累丁二酸，菌体的活力将逐渐减弱而且产酸能力也会受到限制。为了提高细胞的利用效率，建立了细胞的重复批次发酵的工艺。首先在有氧条件下利用大肠杆菌AFP111生长菌体，接着进入第二阶段厌氧产丁二酸。在厌氧条件下，定向改造大肠杆菌使其代谢路径改变，从而消除甲酸、乳酸等副产物的积累^[9]，加强还原TCA途径的代谢流，使得厌氧条件下的代谢主产物为丁二酸，因此实现了丁二酸的大量积累^[10]。待葡萄糖耗尽后进入第三阶段有氧转化，即当一次厌氧发酵结束时，在氮充足条件下进行有氧诱导，因培养基中无葡萄糖存在，丁二酸将被细胞作为碳源消耗合成苹果酸并分泌至胞外，得到了一种新的三阶段合成苹果酸的方法。

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