论文总字数：32165字

摘 要

β-内酰胺类抗生素是目前世界上最为广泛使用的抗感染药物，基于此发展起来的半合成β-内酰胺类抗生素（SSBAs）由于其优越的药理特性，如不易产生耐药性、毒副作用低、抑菌范围广等，广受市场青睐。与传统的化学法合成相比，酶法合成SSBAs具有操作简便，反应条件温和，经济性好等优点。而酶法合成所使用的关键酶即为青霉素G酰化酶（PGA）。通过比较得知，Providencia rettgeri来源的PGA(PrPGA)较其他类型PGA合成活性高，本研究遂将其作为出发酶源，通过氨基酸序列比对，确定影响其合成活性的三个关键位点βF24、αR145、αF146，并进行定点饱和突变，然后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行筛选，得到性能优越的突变体βF24S。之后考察了该突变体在抗生素合成中的实际性能，相较于野生型酶，转化率由原来的51.2%提高到96.1%，反应时间从420min降至120min，合成速率显著提高，并结合高效液相色谱测定了该酶的动力学参数，发现βF24S突变体降低了对产物的水解活性，减少了产物的二次水解，提高了对酰基供体的催化效率，合成性能显著提高。

关键词：SSBAs 青霉素G酰化酶 饱和突变 合成活性

The research on penicillin G acylase in the synthesis of β-lactam antibiotics

ABSTRACT

In today’s world, semi-synthetic β-lactam antibiotics based on β-lactam antibiotics which are the most widely used anti-infection drugs have superior pharmacological properties. They have broad antibacterial spectrum、low toxicity and are difficult to produce drug resistance which are why they are favored by the market. Compared with traditional chemical synthesis, enzymatic synthesis of SSBAs mainly catalyzed by penicillin G acylase has advantages in reaction conditions, operating procedures and economy. When compared PrPGA with PGAs from other sources, we find out its synthetic activity is much higher. In this study, it is used as an original enzyme to determine the three significant sites βF24、αR145、αF146 which affect its synthesis activity a lot through multiple sequence alignments, and perform the site-directed mutation on it. We obtained a mutant βF24S with superior performance by screening mutants which are transformed into E. coli BL21(DE3). Then the actual performance of the mutant in the synthesis of antibiotics was investigated. The result indicates that the synthesis rate was significantly increased, the reaction time was reduced from 420 min to 120 min, and the conversion rate was increased from 51.2% to 96.1%.Combined with high performance liquid chromatography for the determination of substrate and kinetic parameters, it was found that βF24S mutant improved the catalytic efficiency of the acyl donor, reduced the hydrolysis and the secondary hydrolysis activity of the product.

Keywords: SSBAs; Penicillin G acylase; Site-directed mutation; Enzyme catalysis

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1青霉素酰化酶的来源 1

1.2 PGA的反应机理 2

1.3新型PGA的挖掘 3

1.3.1新型PGA的挖掘 4

1.3.2 PGA的分子改造 4

1.4 基于PGA合成的应用现状 5

1.4.1 PGA在前药激活中的应用 6

1.4.2电渗析技术 6

1.5本课题研究内容与研究意义 7

1.5.1研究内容 8

1.5.2研究意义 8

第二章 PrPGA的分子改造以及在抗生素合成中的应用 10

2.1前言 10

2.2实验材料 10

2.3实验方法 14

2.3.1 不同来源PGA合成性能的比较 14

2.3.2对影响PrPGA合成活性的关键位点进行预测 14

2.3.3 PrPGA三个关键位点的饱和突变 14

2.3.4 筛选高合成活性PrPGA突变体 15

2.3.5 PrPGA野生型和βF24S突变体在抗生素合成中的实际应用 16

2.3.6 HPLC检测底物含量 16

2.3.7动力学常数的测定 16

2.4结果与讨论 16

2.4.1 PrPGA与AxPGA、AfPGA催化合成活性的比较 16

2.4.2不同来源PGA氨基酸序列的比较 17

2.4.3筛选高合成活性PrPGA突变体 18

2.4.4 PrPGA野生型和βF24S突变体在抗生素合成中的实际应用 19

2.4.5 PrPGA野生型和βF24S突变体动力学常数的测定 21

2.5本章小节 22

第三章 结论与展望 24

3.1结论 24

3.2展望 24

3.2.1 PGA的稳定性 24

3.2.2 PGA的固定化 24

参考文献 27

第一章 文献综述

Srirangan ^[1]等对β-内酰胺类抗生素在人类历史上所扮演的角色以及发挥的作用做出了恰当的总结，当β-内酰胺类抗生素被人们发现以后，天然青霉素和头孢菌素首先被用作治疗药物，其次充当新一代半合成β-内酰胺类抗生素（SSBAs）的模板。近年来，由于微生物对天然β-内酰胺类抗生素、青霉素和抗菌活性较低的头孢菌素的抗性增加，这便驱动了人们对SSBAs的深入研究。青霉素G酰化酶（PGA，EC 3.5.1.11；青霉素酰胺水解酶，青霉素酰基转移酶）于20世纪50年代被发现，当时由Sakaguchi和Murao ^[2]共同描述。之后，人们又对酶结构、物理化学性质以及生产菌株的合成、诱变进行了探究。

PGA属于N-末端亲核水解酶家族。目前为止，文献已报道了21种可用来生产PGA的细菌、真菌以及酵母菌 ^{[3, 4]}。属于同一酶家族的其他种类的酶有青霉素V酰化酶（PVA，EC 3.5.1.11）和头孢菌素酰化酶（GA，EC 3.5.1.93）。而戊二酰-7-酰化酶（GA, EC3.5.1.93）属于后一类。

请支付后下载全文，论文总字数：32165字