论文总字数：19837字

摘 要

在手性药物、农药和精细化工产品的制备领域，手性醇及其衍生物受到了广泛的应用，是重要的手性砌块；手性药物立体结构不同，其具有不同的药代动力学和药效性能也不同，因此，以单一构型的手性醇为砌块制备手性药物，使药物发挥最佳药效，避免药物对映异构体可能产生的毒副作用，有利于保障人民正确用药及药物安全^[1]。羰基还原酶催化转化潜手性酮制备手性醇是一种绿色经济的途径，与化学方法相比，因其高选择性、温和的反应条件和环境友好而更具优势。但由于目前的生物催化剂不能满足日常生产的需求，所以实际生产手性醇过程中，多数使用化学方法。因此，寻找合适的生物催化剂用于为生物催化是当前的急切任务。本论文以苯乙酮为模式底物，通过测试不同菌株对羰基化合物的还原活性，尝试找出能够应用于工业生产手性醇的全细胞生物催化剂。

关键词：羰基还原酶 手性醇 微生物催化 生物催化

Study on Catalytic Properties of Carbonyl Reductase Catalyzed by Microorganisms

Abstract

Chiral alcohols and their derivatives are widely used in the field of preparation of chiral drugs, pesticides and fine chemical products, and are important chiral building blocks. Chiral drugs have different stereostructures and different pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Therefore, chiral drugs are prepared by using chiral alcohol with a single configuration as building blocks, so that the drugs can exert the best pharmacodynamic effect, avoid toxic and side effects possibly produced by enantiomers of the drugs, and are beneficial to ensuring correct drug use and drug safety of people^[1].Catalytic conversion of latent chiral ketone by carbonyl reductase to prepare chiral alcohol is a green and economic approach. Compared with chemical methods, it has more advantages due to its high selectivity, mild reaction conditions and environmental friendliness. However, because the current biocatalysts cannot meet the needs of daily production, chemical methods are mostly used in the actual production of chiral alcohols. Therefore, it is an urgent task to find suitable biocatalysts for biocatalysis. In this paper, acetophenone is used as model substrates, and the reduction activity of different strains on carbonyl compounds is tested to try to find out the whole cell biocatalyst which can be applied to industrial production of chiral alcohol.

Key Words:Carbonyl reductase; chiral alcohol; microbial catalytic; biocatalyst

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 3

1.1羰基还原反应 3

1.2手性醇的用途 3

1.3 手性醇合成方法简介 4

1.3.1化学法 4

1.3.2生物法 4

1.2羰基还原酶 4

1.2.1羰基还原酶的作用机制 5

1.2.2羰基还原酶在不对称还原合成手性醇的应用 6

1.2.3羰基还原酶的的来源 7

1.3生物催化体系 8

1.3.1 自由酶催化 8

1.3.2 全细胞催化 8

1.4本课题的研究意义 9

第二章实验部分 10

2.1实验试剂 10

2.2实验仪器 11

2.3 实验菌株 11

2.4 培养基、缓冲液配置 12

2.5 实验步骤 13

2.5.1菌种的复苏、传代及培养 13

2.5.2菌体的收集 13

2.5.3 全细胞催化剂催化还原 2 mM 模式底物苯乙酮和肾上腺酮 14

2.5.4 样品处理 15

2.5.5 样品检测 15

第三章 结论与展望 17

3.1 结论 17

3.1.1 菌种鉴定结果 17

3.1.2 全细胞催化转化结果 19

3.2 展望 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 绪论

1.1羰基还原反应

手性醇能够通过将潜手性酮进行不对称还原和动力学拆分外消旋醇获得，其中最实用的方法是羰基化合物的不对称还原。可以使用金属配体作为催化剂来进行不对称催化，也可以通过生物法来实现酮的不对称还原，这是实际生产中最常用的两种方法。生物还原法是指通过生物体内各种参与代谢的物质作用将底物变成期望的产物^.[2]。当使用生物法进行羰基还原反应时，底物的浓度一般较低，如果将底物浓度加大，生物催化剂在这种环境下的耐受性很差，因此生物催化法在实际工业生产的应用受到了制约^[3]。

1.2手性醇的用途

手性醇能够参与生命体内各种反应，其机理在于手性醇手性中心上接有活泼取代基“-OH”。譬如，紫杉醇是一种天然的抗癌药物，它的分子结构中包含手性醇结构，能诱导和促进微管蛋白聚合成微管，抑制形成的微管解聚，因而引起微管束的异常排列以及星状体的产生，阻止细胞在有丝分裂过程中形成有丝分裂纺锤体，于是阻抑了细胞的有丝分裂，引起肿瘤细胞的死亡^[4]。

手性醇还是大量药物及其他手性分子的重要中间体。如抗凝血药物氯毗格雷的关键手性中间体（R）-邻氯扁桃酸甲酯^[5]；S-（2）-氯-1-（3，4-二氯）苯乙醇是抗抑郁药舍曲林的关键手性合成子^[6]。

1.3 手性醇合成方法简介

1.3.1化学法

使用化学方法合成手性醇，一般是利用手性催化剂或手性试剂的作用对羰基化合物进行催化反应，使其还原生成手性醇。我们可以用活性过渡金属制备的配合物作为手性催化剂，例如钌，铑，铱等；硼烷试剂为常用的手性试剂。Kadyrov等人^[7]成功合成了以2,5-二取代噻吩为核心的手性膦配体，新型的手性催化剂由配体与过渡金属钌制得。该催化剂可以催化多种脂肪族和芳香族α-羟基酮生成手性醇，产物的得率和ee值均较好。虽然化学法合成路线较简单，步骤较少，但反应条件苛刻，必须使用昂贵且有毒有害的手性催化剂^[8]。而且在药物合成领域，金属离子的残留受到了严格的限制，有机溶剂的大量使用也不利于化学法制备手性醇在实际生产中的应用^[9]。

1.3.2生物法

生物催化不对称反应是将底物结构中的羰基立体选择性的还原成特定构型的羟基。与化学法相比，生物催化法更加绿色环保、专一性更好、催化效率更高；与外消旋醇的手性拆分法相比，生物法的产率更高，其理论产率可达100%。该法不需要使用繁杂的分离方法来纯化，大大减少了用于分离纯化的成本。但使用此法需向催化体系里添加昂贵的辅酶NAD(P)H来供应负氢，而使用全细胞催化法则可以通过自生的、能够产生辅酶的代谢途径实现辅酶的再生。由于生物催化法适应发展潮流，因此成为了近些年来合成手性药物研究的热门方向^[10]。

1.2羰基还原酶

羰基还原酶(Carbonyl Reductase CRED),又称酮还原酶(Ketoredutase KRED)或者醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH),属于氧化还原酶类,在微生物和动植物体内普遍存在。羰基还原酶在辅酶NADH或者NADPH条件下,能够将底物上羰基结构还原为羟基^[11]。根据不同的底物特异性和动力学参数，羰基还原酶主要分为三大类：短链脱氢酶/还原酶(shortchain dehydrogenases /reductase, SDRs)、中链脱氢酶/还原酶(medium-chain dehydrogenases / reductase, MDRs)和醛酮还原酶(Aldehyde ketone reductase /Aldo-keto reductase, AKRs)^[12]。

1.2.1羰基还原酶的作用机制

辅酶NAD(P)H通过提供氢参与羰基还原酶不对称催化还原潜手性酮合成单一对映醇的过程。其中辅酶的烟酰胺环4位上有pro-S氢和pro-R氢，有4种立体化学构型将来自NAD(P)H的负氢转移到底物上^[13]。在反应过程中，如果羰基的re-面受到负氢原子的进攻，可以得到遵循Prelog规则的产物；若进攻羰基的si-面，则得到anti-Prelog 规则的产物^[14]。自然界中存在的绝大多数羰基还原酶遵循Prelog规则，只有少数遵守anti-Prelog规则^[15]。有报道称Candida tropicalis 46491可以将3，5-二（三氟甲基）苯乙酮还原为反-Prelog 的产物（R）-1-[3,5-二（三氟甲基）苯基]乙醇,ee值达92%^[16]。

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