论文总字数：15959字

摘 要

目的:使用HPLC法测定VB2片的有关物质的含量。采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ;以10mmol/L的NAH2PO4溶液为流动相A，以C2H3N：CH3OH（7:3）为流动相B;按表1进行梯度洗脱;柱温30℃；检测波长为267nm。结论：HPLC法快速、简便，分离效果好。被测成分A\B\C\D的平均回收率分别为101.1%、98.9%、100.1%、99.4%，检测限浓度分别是0.35ng/ml、0.37ng/ml、1.11ng/ml、0.31ng/ml。

关键词：维生素B2片; 高效液相色谱法; 有关物质; 含量

Preliminary Study on Related Substances in

Vitamin B2 Tablets

Abstract

Objective: To determine the content of vitamin B2 tablets by HPLC.Used ODS as a filler; 10mmol / L sodium dihydrogen phosphate solution as the mobile phase A, and acetonitrile: methanol (7: 3) as the mobile phase B;Perform gradient elution according to Table 1; column temperature 30 ℃; detection wavelength was 267nm.Conclusion: The HPLC method is fast, simple, and has a good separation effect.Measured component A \ B \ C \ D are 101.1%, 98.9%, 100.1%, 99.4%, and the detection limit concentrations are 0.35ng / ml, 0.37ng / ml, 1.11ng / ml, 0.31ng / ml, respectively.

Keyword：vitamin B2 tablets;HPLC;related substances;content

目录

文献综述 3

研究背景 3

研究现状及课题选择 4

方法学的选择和原理 4

课题研究的内容和成果 5

研究前景 5

正文 5

1仪器与试药 5

1.1仪器 6

1.2药品 6

2.方法与结果 6

2.1色谱条件 6

2.2制备实验用供试品溶液 6

2.3制备实验用对照品溶液 6

2.4专属性测试结果 6

2.5检出限及定量限 7

2.6线性关系的考察 7

2.7精密度实验 7

2.8重复性实验 7

2.9稳定性试验 8

2.10回收率实验 8

3.讨论 8

3.1避光操作 8

3.2色谱仪的检测波长的选择 8

3.3流动相的选择 8

3.4关于样品溶解 8

参考文献 9

附录：文内图表 12

致谢： 17

文献综述

研究背景

维生素是人们在生活和生产活动中都广泛应用的、甚至不可缺少的成分。作为维生素家族重要的一员，维生素B2的重要性不言而喻。维生素B2，是人体代谢不可缺少的物质之一，微溶于水，在酸或中性溶液中加热稳定，但在碱性加热和光照条件下不稳定，易分解生成杂质。我们在生活饮食中会或多或少的摄入少量的维生素B2，足以供给人体自身代谢所需，但少部分人可能需要摄入更多维生素B2，缺少维生素B2会使人体代谢发生障碍，主要原因是维生素B2会影响生物氧化过程。缺少过多甚至会引发一系列炎症，如口角炎、唇炎等。维生素B2的生产应用大部分是在饲料领域，因为人体可以通过饮食使体内维生素B2达到平衡，而人工饲养的动物却很需要管理者来搭配营养成分。我国在世界饲料的维生素B2添加剂市场中起到了很重要的作用，甚至于推动了饲料行业的发展，目前，也在积极推动如何在这个行业占有更大的行业优势。所以，无论从生活还是生产，维生素B2都是一个值得研究的对象。

研究现状及课题选择

作为一款现对成熟且应用广泛的药剂，针对维生素B2的研究已经有许多值得分析和采纳的成果。无论是针对维生素B2在医药还是饲料领域的研究都已经相对成熟，有研究生产加工过程的，有研究如何减少储存过程怎样减少消耗的，也有研究维生素B2在人体或动物体内作用机理的，当然也少不了作为方法学验证的样品。而我所选择的研究课题是维生素B2片中有关物质的初步研究，更多的是根据维生素B2的在碱性加热和光照的情况下不稳定特性进行的一个研究，具体而言就是对样品维生素B2进行碱性、酸性、加热、光照等处理，使其分解产生杂质，再对产生的杂质进行方法学验证。课题的研究相对简单，但兼顾了维生素B2的特性研究和相关的方法学验证，是一个不错的锻炼课题。

方法学的选择和原理

对于维生素B2有关物质的研究的可以取用的方法学有很多，比如说紫外分光光度法，HPLC法，每个都有各自的特点和优点。本次课题研究我采用的是HPLC法，又称高压液相色谱法。一是因为这个方法简便而且准确；二是对实验室所提供实验设备的考量。主要介绍一下HPLC法的原理：以液体溶液作为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。本课题用的是液液分配的分离方式，就是流动相和固定相都是液体溶液，本实验研究用10毫摩尔每升L的NaH2PO4·2H2O当流动相A，用C2H3N：CH3OH（7:3）当流动相B。流动相和固定相之间应该是不会互溶的，有一个很明显的分界面，这是为了防止固定液流失。当样品溶液进入到色谱柱后，溶质在两相间分离，达到平衡的时候，符合HPLC计算公式。

课题研究的内容和成果

根据维生素B2的特性：在碱性和光照条件下不稳定，通过酸、碱、光、热处理，用HPLC法检测产生的杂质，对结果进行分析，从而得出相应的结论。经过实验和检测，发现维生素B2片经碱破坏产生的杂质比经过酸破坏产生的杂质含量多^[1]。而这也验证了维生素B2在酸和中性溶液稳定，在碱性和光照条件下不稳定的特性。目前，维生素B2更广泛的使用在食品添加剂中，而医药领域占比较小，但是无论怎么使用，都无法忽视维生素B2的药理性质，在以后的研究报告中，可能会更多的偏向于如何提高其在各种环境中的稳定性，来提高药品的适用广度。作为我的本科毕业论文，根据我自身的学识水平，选择了比较容易的一个课题：维生素B2片中有关物质的研究。我学识浅陋，不敢说开拓研究，本文只是在通过初步研究维生素B2片中有关物质来进一步加强我对药剂药理、实验过程的深入学习。本次课题也是对自己大学四年成果的一次检验和锻炼，过程磕磕绊绊，不敢说有什么成果，但对于自己还是有所收获的。

研究前景

维生素B2的作用不言而喻，无论是在医药领域还是在食品添加剂方面都有很重要的作用。对于维生素B2的研究，一方面可以提高我们的生活品质，一方面可以在国际维生素添加剂市场中取得更大的话语权，因此，对于维生素B2的研究可以说会一直持续。

正文

1仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪（实验室）；电子天平；药品光照箱（照度：4500Lx±500Lx）。

1.2药品

维生素B2片(实验用）;乙腈、甲醇均为色谱纯；水为重蒸馏水;1.0ml的0.5mol/L的氢氧化钠溶液,冰乙酸为分析纯；10mmol/L的磷酸二氢钠溶液为高效液相色谱专用试剂；其余试剂均为分析纯。

2.方法与结果

2.1色谱条件

用ostade-cylsilane来当色谱仪的填充剂；用10毫摩尔每升L的NaH2PO4·2H2O当流动相A，用C2H3N：CH3OH（7:3）当流动相B；进样量100ul；柱温30℃；检测波长为267nm^[3]。

2.2制备实验用供试品溶液

称得一定量实验用的药品细粉（大概就是维生素B2 10mg）精确量取，放到100ml量瓶中，缓缓倒入HCL溶液（1→2）5毫升，左右晃动量瓶让VB2溶解在溶液中，慢慢倒进实验用纯水10ml，继续振摇数分钟^{[3] [4] [5] [8] [10]}。加入实验纯水到量瓶的刻度为止，摇晃让溶液混合，进行过滤操作，留下续滤液当实验用供试验用品溶液^[2]。

2.3制备实验用对照品溶液

准确地取用“2.2”供试品溶液一定的量，加入实验用纯水稀释让它成为符合每1ml含有维生素B2约为0.10μg的溶液当对照溶液^{[3] [4]}；精密称取杂质C对照品、杂质D对照品约1mg置10ml量瓶，加溶剂（流动相A：流动相B=9:1）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质C与杂质D储备液，取储备液加水制成每1ml中含有杂质对照品C 、D各约 0.3μg的混合溶液，作为定位溶液1（包含杂质C、杂质D）；另取本品约10mg，置100ml量瓶中，加入1.0ml的0.5mol/L的氢氧化钠溶液溶解，于药品光照箱（照度：4500Lx±500Lx）放置1.5h，加入0.5ml的冰乙酸，用水定容至刻度，摇晃使溶液混均匀，作为定位溶液2（包含杂质A、杂质B）。

2.4专属性测试结果

准确地取用杂质定位溶液1、杂质定位溶液2、对照溶液及供试品溶液每样100微升，依次使用液相色谱仪测量^{[3] [4] [5] [9]} , 按上面的步骤提到的的色谱条件进行测定。在试验中我发现，经历光照、氧化破化、碱破环, 都发现了部分降解, 杂质有所增多, 在高温、酸破环过程中杂质没有很明显的加多。因为空白溶液在这些实验过程中有一些干扰, 所以在计算的时候, 所以去掉空白的辅料和溶剂溶液的干扰^[4]。如果发现有与杂质A、B、C、D保留的时间相同的供试品溶液的图谱的色谱峰，杂质A比照修正后的峰面积去算的话（乘以校正因子0.7）不得大于对照溶液主峰面积的0.25倍（0.025%），杂质C比照修正后的峰面积去算的话（乘以校正因子2.4）也不能比对照溶液主峰面积的2倍（0.2%）还大；杂质B不能比对照溶液主峰面积的2倍（0.2%）还大，杂质D不得大于对照溶液主峰面积的2倍（0.2%），其他的单个的杂质的峰面积不能够大于对照溶液主峰面积（0.2%），杂质的总量不能大过2.0%，供试品溶液的色谱图中除了杂质A以外，其他的小于对照溶液主峰面积的0.5倍的峰可以不纳入计算（0.05%）^{[3] [4] [5] [11]}。详见表2。

2.5检出限及定量限

准确地取用杂质定位1、杂质定位2、对照溶液和供试品溶液每个100微升，依次错开使用液相色谱仪进行测量, 照“2.1”的色谱条件进行测定, 检出限浓度分别为杂质A0.35ng/ml，杂质B0.37ng/ml,杂质C1.11ng/ml,杂质D0.31ng/ml，详见表3。

2.6线性关系的考察

精密量取杂质定位溶液1、杂质定位溶液2、对照溶液及供试品溶液各5、10、15、20、30、40 微升依次用液相色谱仪检测, 照实验设定的色谱条件, 用各溶液的进样量 (μg) 当横坐标X, 用色谱峰面积当纵坐标Y, 计算各自的回归方程^{[3] [4] [9] [10]}。

2.7精密度实验

取杂质定位溶液1、杂质定位溶液2、对照溶液和供试品溶液，每一项都依次用色谱仪测量6次, 根据显示的色谱图, 按照给出的峰面积计算杂质A\B\C\D的RSD (n=6) 分别为0.76%、0.44%、0.09%、0.18%，以此判断出HPLC法的测量准确性确实好^[4]。

2.8重复性实验

取杂质定位溶液1、杂质定位溶液2, 每样都是6份, 准确地取用20 μL使用液相色谱仪进行测量,记下色谱图,根据外标法计算, 杂质A\B\C\D样品平均含量分别为NA, 0.025%, NA, 0.087%^[8]。未知单一杂质2平均含量0.049%，总的杂质（0.05%以下不计）含量0.102%。上述的杂质A\B\C\D和单杂、总杂的RSD分别是未知、5.68%、未知、4.50%、13.86%、17.38%,详见表4。

2.9稳定性试验

取杂质定位溶液1、杂质定位溶液2, 在0、2、4、6、10和24 h的时间点分别进样20 微升^[4], 记下显示的色谱峰的面积, 杂B的RSD=8.00%，杂D的RSD=3.50%。详见表5。

2.10回收率实验

分别量取杂质定位溶液1、杂质定位溶液2，照我实验选定的色谱条件进行测量, 低、中、高3个浓度的回收率 (n=3) 分别为80%, 100%, 120%^[4]，杂质A\B\C\D的平均RSD是101.1%、98.9%、100.1%、99.4%,详见表6。

3.讨论

3.1避光操作

维生素B2即核黄素，因其对光敏感, 紫外线可促进破坏, 所以在及检验过程中均应注意避光操作^{[3] [7] [9] [10]}。

3.2色谱仪的检测波长的选择

查阅文献得知，维生素B2的最大吸收波长主要在267、375、444纳米三处,维生素B2片杂质峰的最大吸收波长主要在267、444纳米处^[4]。而我检测的是维生素B2片剂中的杂质含量，由于以上原因我选择测量的波长是267纳米, 主要是方便物质含量的测定。

3.3流动相的选择

用高效液相色谱法测维生素B2和其有关物质的含量的研究有很多，流动相大多由甲醇、10 mmol·L-1磷酸二氢钠水溶液^{[3] [4]}，与此同时尝试调整主峰的保留时间的一个方法是添加乙腈, 又因为维生素B2在碱性的溶液里容易分解并且在酸性的溶液里有比较稳定的性质的特性，综上所述，本次实验我取用的是“甲醇—乙腈—10 mmol·L-1磷酸二氢钠溶液 ”为流动相^[4]。

3.4关于样品溶解

维生素B2在水中的溶解度较低，在碱性溶液中的溶解度稍高但维生素B2在碱性环境里的降解时间短，这对于实验的进行和检测来说是一个不好的因素^[4]。所以，在试验过程中为了检测维生素B2有关物质的含量等操作而做准备的溶解维生素B2是一个比较重要的节点,今天，在中国药典2015版维生素B2片剂的第二部分中是加入冰醋酸溶液，之后水浴加热1个小时，这样基本可以认为药品已经完全溶解，但是也有一些缺点，比如实验进行的时间延长了^{[1] [4]}。由于片剂中含有一定量的辅料，加入少量的盐酸溶液不利于粉末完全浸泡在溶液中。 在查阅文献资料后，决定增加盐酸1→2的添加量，服用维生素 b 2片剂，加入1→25毫升盐酸溶液，摇动溶解维生素 b 2，加入10毫升水冲洗瓶壁上残留的药品，确保药品的完全溶解^[4]。

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典[S]：四部通则.北京中国医药科技出版社.2015.

[2]Brian JP, Elizabeth LF.Rapid determination of vitamin B2 (ribofla-vin) in plasma by HPLC[J].Clinica Chimica Acta, 2011, 412 (1/2) :38-43.

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