论文总字数：14682字

摘 要

采用酶法降解的方式制备一系列低聚合度的岩藻寡糖混合物，并通过电喷雾质谱(ESI-MS)对降解得到的岩藻寡糖混合物物进行结构表征，使用ABTS法、DPPH法及羟基自由基清除法对寡糖混合物的抗氧化活性进行了评价，以嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）为对象表征了寡糖混合物的益生活性。电喷雾质谱表征分析获得了岩藻寡糖的组成为：一组低聚合度的硫酸化岩藻寡糖，其中主要有[Fuc_1-4SO₃Na-Na]^-，[Fuc_4-5(SO₃Na)₂-Na]^-和 [Fuc_4-5(SO₃Na)_3-4-Na]^-等。在益生元活性和抗氧化活性试验中，可以清楚的观察到岩藻寡糖对嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的增殖具有良好的促进效用，而且岩藻寡糖还具有较好的ABTS ^·自由基和·OH自由基清除能力。不断添加岩藻寡糖直到浓度达到10 mg/mL ，此时岩藻寡糖对ABTS ^·自由基的清除率为93.83%，对DPPH自由基的清除率为94.91%，以及对·OH自由基的清除率为70.49%。

关键词：岩藻寡糖 酶法制备 结构表征 抗氧化活性 益生活性

Activity evalation of fucoidan oligosaccharides

Abstract

The Fucoidan Oligosaccharides (FOS) were prepared by enzymatic degradation of Fucoidan and structurally identified by Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS). Theantioxidant activity of the FOS was investigated by ABTS method, DPPH method and hydroxyl radical scavenging method. In addition, the probiotic activity of the FOS was determined by Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus. The ESI-MS analysis indicated the mixture include series of FOS with low degree of depolymerization such as [Fuc_1-4SO₃Na-Na]^-，[Fuc_4-5(SO₃Na)₂-Na]^- and [Fuc_4-5(SO₃Na)_3-4-Na]^-.In the test of prebiotic activity and antioxidant activity, it can  be clearly observed that FOS has a good promoting effect on the proliferation of  Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus plantarum,and FOS also has a good  ability of ABTS ^· radical and ·OH radical scavenging.When the concentration of FOS reached 10 mg/mL, the removal rates of ABTS ^· radical ,DPPH radical and ·OH  radical were respectively 93.83% , 94.91% and 70.49% .

Key Words:fucoidan；oligosaccharides;enzymatic；preparation; structural；characterization; antioxidant activity; probiotic activity

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1 课题研究背景 1

1.2 研究目的、意义和主要研究内容 1

1.2.1 研究意义 1

1.2.2 研究目的和内容 2

第二章 实验材料与方法 3

2.1 材料与试剂 3

2.2 仪器与设备 3

2.3 实验方法 3

2.3.1 岩藻寡糖的酶法制备 3

2.3.2 岩藻寡糖的电喷雾质谱分析 3

2.3.3 岩藻寡糖的体外抗氧化活性分析 4

2.3.4 岩藻寡糖的益生活性分析 5

2.4 数据统计分析 5

第三章 结果与讨论 6

3.1 岩藻寡糖的制备与结构鉴定 6

3.1.1 岩藻多糖水解的还原糖曲线 6

3.1.2 岩藻寡糖的结构鉴定 6

3.2 岩藻寡糖的体外抗氧化活性 8

3.2.1 岩藻寡糖的ABTS ^·自由基清除能力 8

3.2.2 岩藻寡糖的·OH自由基清除能力 8

3.2.3 岩藻寡糖的DPPH自由基清除能力 9

3.3 岩藻寡糖对于植物乳杆菌的益生活性 10

第四章 结论与展望 12

4.1 结论 12

4.1.1岩藻寡糖的制备 12

4.1.2岩藻寡糖的体外抗氧化活性 12

4.1.3 岩藻寡糖的益生活性 12

4.2 展望 12

参考文献 13

致谢 16

前言

1.1 课题研究背景

岩藻多糖是海带（Laminaria japonica）、裙带菜（Undaria pinnatifida Suringar）等大型褐藻门植物细胞间组织的主要成分，其结构上是由L-岩藻糖作为主链骨架，并通过1,2或者1,3及1,4糖苷键与其他多种糖残基（甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和木糖等）及硫酸基结合形成的一种天然杂多糖^[1]。通过研究得出，岩藻多糖生物活性丰富，例Silva等研究发现从Padina gymnospora中提取出的岩藻多糖表现出较强的抗凝血活性，其结构中的4-α-L-岩藻糖单元C3位置的硫酸酯含量与其自身的抗凝血活性密切相关^[2]。此外，Rocha等研究发现，来源于Spatoglossum schroederi的岩藻多糖在体外实验中未表现出抗凝血活性，但是在形成血栓的动物模型中却表现出显著的抗血栓形成作用^[3]。已有文献报道，硫酸化的多糖例如岩藻多糖、卡拉胶等在实验中都表现出了抗病毒活性，其中Hayashi等研究发现来源于Undaria pinnatifida的岩藻多糖可以有效抑制单纯疱疹病毒(HSV)的增殖，并能增强其免疫功能来抵御HSV病毒的入侵^[4]；Hidari等研究发现岩藻多糖可以有效抑制登革热II型病毒的侵染，其中岩藻多糖与DEN2颗粒进行特异性地结合来达到抑制病毒与细胞合体的形成的效果^[5]。此外，岩藻多糖还表现出显著的抗肿瘤活性，Alekseyenko等发现岩藻多糖可以有效抑制小鼠肺腺癌细胞的转移^[6]；Hyun等研究发现，利用岩藻多糖处理HCT-15结肠癌细胞后，部分细胞出现DNA断裂等细胞凋亡现象，可有效抑制结肠癌细胞的生长和转移^[7]。另外，岩藻多糖还具有多种免疫调节活性，Tissot等研究证实岩藻多糖可以抑制正常人血清中的补体蛋白，以此来抑制细胞中补体的激活^[8]；Mizuno等发现岩藻多糖可以刺激RAW264.7细胞产生肿瘤坏死因子，从而抑制细胞中白介素mRNA的表达^[9]。

1.2 研究目的、意义和主要研究内容

1.2.1 研究意义

岩藻多糖具有上述多种生物活性，受到了越来越多的来自于药物研发、功能食品开发等领域的研究者的重视与关注，但是有关岩藻多糖的益生等活性的研究却鲜有报道。而且，岩藻多糖存在分子量大、吸收性差、难以通过血脑屏障及吸收率低等缺点，其应用受到了一定限制^[10]。作为岩藻多糖的降解产物，岩藻寡糖具有分子量小、水溶性和吸收性好、生物利用度高等多种岩藻多糖所不具备的优点，克服了多糖在应用过程中受到的种种限制，在功能食品开发、新型保健品开发等领域具有很好的应用前景。因此，通过适当的方法将岩藻多糖的分子量降低，将其降解成小分子的寡糖是目前岩藻多糖及其产品开发亟待解决的问题。

1.2.2 研究目的和内容

本研究采用酶法降解的方式以岩藻多糖为原料制备了不同聚合度的岩藻寡糖混合物，通过电喷雾质谱对其结构进行了表征，并采用多种方法对降解得到的岩藻寡糖的抗氧化及益生元活性进行研究，为岩藻多糖资源的开发奠定了基础。

第二章 实验材料与方法

2.1 材料与试剂

岩藻多糖购于山东结晶集团（来源于海带Laminaria japonicia）；ABTS、DPPH自由基购于美国Sigma公司；透析袋（分子量100 Da）购于索莱宝公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, BIO-097551）和嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus, BIO-099454）购于CICC。本实验中所用的岩藻多糖降解酶由本实验室制备，该酶的编码基因克隆自海洋细菌Formosa algae，实验时将其转化到大肠杆菌Escherichia coliBL21 (DE3)体内进行重组表达，然后产物由亲和层析柱进行纯化；正丁醇（AR）、无水乙醇(AR)、氯化钠(AR)、浓硫酸(AR)、苯酚(AR)、氯仿(AR)、水杨酸(AR)、抗坏血酸(AR)、丙酮(AR)和石油醚(AR)等化学试剂。

2.2 设备和仪器

NZL-10TD压盖型冷冻干燥机，上海左乐仪器有限公司；ViVO-Itherm-B5开口加热循环浴槽，北京卓川电子科技有限公司；V- 7100紫外-可见光分光光度计，日本JASCO公司；C510防腐蚀隔膜真空泵，德国Chemvak公司；ROTINA380/380R高速台式冷冻离心机，德国Hettich公司;LTQ XL线性离子阱质谱分析仪,美国赛默飞世尔公司。

2.3 实验方法

2.3.1 岩藻寡糖的酶法制备

称取20 g岩藻多糖溶于2000mL去离子水中，加入适量岩藻多糖降解酶进行水解反应，反应温度为30 ℃，反应时间48 h后，用DNS法测定不同反应时间的还原糖含量^[11]，将反应体系加热到100 ℃来终止反应。将反应体系进行冷冻干燥，得到岩藻寡糖粉末。

2.3.2 岩藻寡糖的电喷雾质谱分析

取少量降解得到的寡糖用透析袋除去里面的无机盐等小分子杂质，冻干后得到样品，溶于用水和乙腈按照1:1体积比例混合得到的样品液，取2 L样品用LTQ XL线性离子阱质谱分析仪进行负离子模式分析，条件如下：

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