摘 要

羟丙基壳聚糖是在异丙醇溶液中由碱化后的壳聚糖与环氧丙烷反应制得的，是具有良好水溶性的壳聚糖衍生物。它具有良好的水溶性以及广泛的适用pH环境，还具有抗氧化性、抗菌性、吸湿保湿性以及乳化性。丝素肽（SFP）是丝素蛋白水解后的产物，含有对人体有益的18种氨基酸，具有独特的抗氧化、降低胆固醇等性能，丝素肽在护肤护发、生物制药和功能性保健食品等方面有很重要的利用价值。

本论文主要研究内容如下：

首先碱化壳聚糖，然后在异丙醇中与环氧丙烷反应制备羟丙基壳聚糖，再通过MTGase的催化作用将丝素肽接枝到羟丙基壳聚糖中，制备得到羟丙基壳聚糖-丝素肽。考察不同反应条件对产物取代度的影响，得出最大取代度对应的反应条件为：反应时间2 h，反应温度40℃，投料质量比（m_SFP/m_HPCS）1.2。对所制备的衍生物进行红外表征，证明丝素肽成功接枝到了羟丙基壳聚糖上。吸湿、保湿实验表明，壳聚糖结构中引入羟丙基后，提升了壳聚糖的吸湿、保湿性能，在接枝丝素肽后，随着丝素肽取代度的增大，羟丙基壳聚糖-丝素肽的吸湿、保湿性能也不断上升。对·OH和DPPH清除性能的实验表明，羟丙基壳聚糖-丝素肽对·OH和DPPH的清除率随取代度和浓度的增大而明显增加。

关键词：羟丙基壳聚糖；丝素肽；伤口敷料；取代度；抗氧化性。

ASTRACT

Hydroxypropyl chitosan is prepared by reacting alkalized chitosan with propylene oxide in an isopropanol solution, and is a chitosan derivative having good water solubility.It has good water solubility and a wide range of suitable pH environments. It also has antioxidant, antibacterial, moisture absorbing and emulsifying properties.Silk fibroin peptide (SFP) is a product of silk fibroin hydrolysis. It contains 18 kinds of amino acids beneficial to human body. It has unique antioxidant and cholesterol-lowering properties. Silk fibroin peptides are used in skin care and hair care, biopharmaceuticals and functional health foods. Other aspects have important value in use.

The main contents of this thesis are as follows: First to alkalinize chitosan,then reacted with propylene oxide in isopropanol to prepare hydroxypropyl chitosan, and then the silk fibroin peptide is grafted into hydroxypropyl chitosan by the catalytic action of MTGase to prepare hydroxypropyl chitosan-silk fibroin peptide.The effects of different reaction conditions on the degree of substitution of the product were investigated. The reaction conditions corresponding to the maximum degree of substitution were as follows: reaction time 2 h, reaction temperature 40℃, feed ratio (m_SFP/m_HPCS) 1.2. Infrared characterization of the prepared derivatives confirmed that the silk fibroin peptide was successfully grafted onto hydroxypropyl chitosan.Moisture absorption and moisturizing experiments showed that the introduction of hydroxypropyl group in chitosan structure improved the moisture absorption and moisturizing properties of chitosan. After grafting silk fibroin peptide, with the increase of silk fibroin substitution degree, hydroxypropyl group The hygroscopicity and moisturizing properties of hydroxypropyl chitosan-silk fibroin peptides are also increasing.Experiments on the·OH and DPPH scavenging performance showed that the clearance of hydroxypropyl chitosan-silk fibroin peptides for·OH and DPPH increased significantly with increasing degree of substitution and concentration.

KEY WORDS: hydroxypropyl chitosan; silk fibroin peptide; wound dressing; degree of substitution; antioxidant.

目 录

摘 要 I

第1章 绪论 1

1.1 引言 1

1.2 羟丙基壳聚糖概述 1

1.2.1 羟丙基壳聚糖的制备 1

1.2.2 羟丙基壳聚糖的性质 2

1.2.3 羟丙基壳聚糖的应用 3

1.3 丝素肽概述 4

1.4 转谷氨酰胺酶概述 5

1.5 本课题研究内容与意义 6

第2章 羟丙基壳聚糖-丝素肽的制备与性能研究 8

2.1 引言 8

2.2 实验部分 8

2.2.1 实验试剂和仪器 8

2.2.2 羟丙基壳聚糖的制备 9

2.2.3 MTGase的纯化 9

2.2.4 羟丙基壳聚糖-丝素肽的制备 10

2.2.5 羟丙基壳聚糖-丝素肽的红外表征 10

2.2.6 羟丙基壳聚糖-丝素肽取代度的测定 10

2.2.7 羟丙基壳聚糖-丝素肽吸湿保湿性的测定 12

2.2.8 羟丙基壳聚糖-丝素肽抗氧化性的测定 12

2.3 结果与讨论 13

2.3.1 羟丙基壳聚糖-丝素肽的红外表征 13

2.3.2 羟丙基壳聚糖-丝素肽反应条件优化 14

2.3.3 羟丙基壳聚糖-丝素肽的吸湿、保湿性能 16

2.3.4 羟丙基壳聚糖-丝素肽的抗氧化性能 17

第3章 结论 19

参考文献 20

致谢 23

第1章 绪论

1.1 引言

皮肤是与外界环境直接接触的一种组织，是人体的一层保护膜，对人体起着极其重要的保护作用。它可以作为防止微生物入侵的有效保障，保护身体免受热、化学和机械的损伤，并具有允许吸附和选择性渗透化学物质的性质。柔软、细腻、微湿、富有弹性，pH值为5-5.6的皮肤才是健康的。当皮肤的完整性被破坏后，其在免疫系统所起的作用将受到严重影响。大量研究表明合适的湿润环境有利于伤口的愈合。而新型敷料具备保持创面湿润和促进伤口愈合的功效^[1]。目前市场上用于伤口治疗的聚合物有果胶、甲壳素衍生物、明胶、聚己内酯、透明质酸等。

甲壳素是自然就中的第二大生物衍生资源，广泛存在于虾、蟹、昆虫等甲壳动物的外壳和菌、藻类低等植物的细胞壁中，甲壳素通过脱乙酰作用可以将甲壳素转化为具有游离氨基的壳聚糖。作为自然界中唯一的碱性多糖，壳聚糖材料具有生物可降解性和生物相容性，广泛应用于医药、食品、化工和化妆品等领域。壳聚糖在伤口的治疗方面具有许多优点，如壳聚糖可以舒缓伤口疼痛，还可以促进伤口愈合及减少疤痕，此外，壳聚糖具有抑菌活性和抗肿瘤活性，还具有明显的降血压、降血脂、调节血糖的功能^[2]。为了扩大壳聚糖的应用范围以及增加其附加值，常对壳聚糖进行功能化修饰、改性^[3]。

1.2 羟丙基壳聚糖概述

羟丙基壳聚糖（hydroxypropyl chitosan,HPCS）是一种常见的壳聚糖衍生物，是碱化后的壳聚糖在异丙醇溶液中与环氧丙烷反应制得的 。亲水性羟丙基基团的引入，改变了壳聚糖的空间结构导致氢键作用减弱，从而提高了其水溶性并改善了其反应活性，对于进一步制备各种壳聚糖的衍生物，扩展壳聚糖在各领域的应用具有实用意义^[4]。

1.2.1 羟丙基壳聚糖的制备

将20 g 壳聚糖溶20 mL 50% NaOH溶液中搅拌使其充分混合，静置于-18℃冰箱中碱化24 h。将碱化后的壳聚糖加入到160 mL 异丙醇中常温搅拌30 min，加入1.6 mL 四甲基氢氧化铵，常温搅拌2 h，升温到45℃，加入200 mL环氧丙烷，反应20 h，抽滤，用乙醇洗涤，再抽滤，重复几次后，水溶透析。

1.2.2 羟丙基壳聚糖的性质

1.2.2.1 水溶性

与壳聚糖相比，羟丙基壳聚糖引入了具有亲水性的羟丙基基团，破坏了分子排列的规整性，减弱了氢键的作用力，从而提高了其水溶性，并且羟丙基壳聚糖的取代度越大，引入的羟丙基就越多，其水溶性就越好，当取代度大于等于0.40时，羟丙基壳聚糖可在水中完全溶解^[5]。

1.2.2.2 吸湿保湿性

羟丙基壳聚糖在壳聚糖的结构上引入了极性羟丙基基团，增强了亲水能力。施亦东等^[6]制备羟丙基壳聚糖并对其保湿、吸湿性进行研究，结果表明在羟丙基化的羟丙基壳聚糖和壳聚糖在同等高湿度下，壳聚糖在2 h吸湿率达到上限，而羟丙基壳聚糖在24 h仍然呈上升趋势；袁毅桦等^[7]同样研究了不同湿度下壳聚糖和羟丙基壳聚糖的吸湿率和保湿率，结果表明在不同湿度条件羟丙基壳聚糖的吸湿保湿性能都明显高于壳聚糖。所以羟丙基壳聚糖比壳聚糖更有利于用在日用化妆品中。

1.2.2.3 抗菌性

羟丙基壳聚糖的抗菌性来源于分子内的-NH₂基团，在溶液环境下，-NH₂能与自由H 结合形成-NH₃ 阳离子，-NH₃ 离子能与细菌细胞壁上的负电性阴离子结合，使细胞壁和细胞膜上的负电荷分布不均，打破其在自然状态下细胞壁的合成和溶解平衡，破坏细菌正常生理代谢，抑制其繁殖能力，从而起到抗菌的效果^[8]。壳聚糖的抗菌性原理和羟丙基壳聚糖相似，但由于壳聚糖为弱碱性聚电解质其水溶性又不好，容易因为pH环境失去抗菌能力^[9]。杨自芳^[10]等从分子生物学角度解释羟丙基壳聚糖的抗菌性，即羟丙基壳聚糖分子通过进入细菌细胞内部，与核内的核糖亚单元分子片段相互作用，破坏了细菌体内DNA转录的过程，从而干扰阻碍mRNA的翻译，进而抑制细菌繁殖，达到抗菌的效果。

羟丙基壳聚糖的抗菌性目前常应用于医疗器械的填充。庞凯敏等^[11]研究了羟丙基壳聚糖改性硅橡胶性能，结果表明，添加羟丙基壳聚糖在1.5%时，SiR/羟丙基壳聚糖复合材料就有良好的抗菌性能，且随着添加量的增加杀菌率也有提高。Xie Yajun^[12]等研究水溶性壳聚糖衍生物的抗菌活性，结果表明，羟丙基壳聚糖对大肠杆菌有显著的抑制作用且抑制因子为-NH₂。

1.2.2.4 吸附性

羟丙基壳聚糖具有吸附性，其吸附性原理与壳聚糖相似，两者在溶解换下形成-NH₃ ，使其周围形成带正电荷的区域，产生静电吸附作用，且羟丙基壳聚糖的溶解性相对于壳聚糖来说更好，所以其具有比壳聚糖更强的吸附性。羟丙基壳聚糖一般为聚合物高分子，在液态环境下容易形成凝胶，通过黏附作用吸附离子。杨晋青等^[15]研究了羟丙基壳聚糖对Cr（VI）离子的吸附性能，结果表明羟丙基壳聚糖产生的静电吸附，可以很好的吸附Cr（VI）离子，而且羟丙基壳聚糖通过交联可以明显提高对Cr（VI）的吸附能力，同时还可以用于吸附其它重金属离子如锰、镍等。

1.2.2.5 抗氧化性

由于壳聚糖引入了亲水性羟丙基，使得其氢键作用力减弱，于是羟丙基壳聚糖中更多的自由氨基和羟基暴露出来，而活性氨基有助于提高壳聚糖衍生物的抗氧化性，羟基的暴露相当于增强了对羟自由基的清除能力，所以羟丙基壳聚糖具有更加强的抗氧化性^[13]。程华珍^[14]研究了不同取代度的羟丙基壳聚糖在相同条件下对羟自由基的清除能力，结果表明羟丙基壳聚糖对羟自由基的清除能力同其浓度有很好的相关性。

1.2.2.6 其他

羟丙基壳聚糖由于其良好的凝胶型和配伍性，可应用于医药领域，通过用羟丙基壳聚糖制备载药纳米微球来提高药物药效和药物稳定性^[16]。尚晓娴等^[17]制备羟丙基壳聚糖纳米微球并研究其其缓释效果，结果表明采用羟丙基壳聚糖纳米微球载药可以有效延长药物释放时间，提高了药物药效和释药性，并提高了药物稳定性。

此外，羟丙基壳聚糖应用于造纸过程中，可以有效地加强纸质纤维之间的氢键结合来提高纸张的物理强度。孙振乾等^[18]研究了羟丙基壳聚糖对纸质文物保护的应用，结果表明，用羟丙基壳聚糖处理纸样，可以显著提高其抗张强度与耐折度，这可以很好地减少纸质文物的磨损，起到保护的作用。安呈峰等^[19]研究了羟丙基壳聚糖对小麦幼苗生理功能的影响，结果表明，羟丙基壳聚糖能影响小麦中的核酮糖二磷酸羧化酶、硝酸还原酶等酶活性，进而促进小麦氮代谢，增强其抗性并提高其光合作用效率。

1.2.3 羟丙基壳聚糖的应用

1.2.3.1 包裹药物

壳聚糖由于其来源丰富、性质稳定、无毒、优良的生物相容性和成膜性等优点^[20]，以及阻止药物扩散及溶出等特性，很适合用于药物载体。但壳聚糖较差的水溶性极大限制了其应用，而其衍生物羟丙基壳聚糖由于保持其原有的碱性和正电性并具有优异的水溶性，常用于替代壳聚糖作为药物载体。胰岛素是治疗糖尿病的主要药物，胰岛素若不经过特殊包埋技术处理而直接口服，在胃肠道中的容易被酶水解而失活，或因肝脏首过效应而受到破坏，这会使得胰岛素利用度极低，达不到治疗的效果^[21]。来水利等^[22]以羟丙基壳聚糖为壳材，以胰岛素为芯材，在室温下制备了平均粒径为13.34 μm的微球，并考察了微球的各种性能，结果表明此微球具有延长胰岛素向外扩散的作用，且制备过程是在室温下进行的，还有减少制备过程中胰岛素失活，避免在高温下羟丙基壳聚糖分子链断裂的优点。

1.2.3.2 伤口敷料

伤口指受伤破裂的地方，创伤愈合是伤口的愈复过程。伤口的创伤愈合的基本过程主要是从急性炎症期到细胞增生期、瘢痕形成期，最后到表皮及其他组织再生。创伤愈合应当避免一些不利因素，创造有利条件促进组织再生修复。而伤口敷料可以有效防止微生物入侵，是覆盖于损伤皮肤后还能够起到保持水分，维持电解质平衡，止血，止痛，促进伤口愈合等作用。胡张艳^[23]组成中含有羟丙基壳聚糖的静电纺丝网与胶原蛋白溶液制备出一种手术伤口愈合凝胶敷料，其具备良好的生物降解性，而且具有很好的生理适应性，抗菌性强，可以促进手术伤口的愈合和上皮细胞的生长。魏青松^[24]通过将无纺布浸渍在含羟丙基壳聚糖的复合处理液中得到一种促进伤口愈合的医用无纺布，其直接敷贴在伤口可以起到强力杀菌作用，并可以防止感染，消肿止痛，促进伤口愈合。

1.2.3.3 化妆品

羟丙基壳聚糖具有与细胞外基质多糖相类似的性质，包括水溶性，高粘度，大渗透压和凝胶形成能力等。羟丙基壳聚糖在化妆品领域中的一般用作于保湿剂、乳化剂、抗氧化剂。在一般湿度条件下羟丙基壳聚糖所具有的吸湿保湿能力都比壳聚糖强，且羟丙基壳聚糖具有比壳聚糖更优异的水溶性，还带有正电荷并具有较大的分子量，这使它能够很好的粘附到皮肤上并保持较长时间，故其可以作为皮肤的保湿剂^[25]。隋伟平等^[26]研究了羟丙基壳聚糖及其疏水改性衍生物的应用性质，结果表明经疏水改性后的羟丙基壳聚糖具有更强的起泡性，其泡沫稳定性也有着明显提高，由于改性后羟丙基壳聚糖上带有疏水基团，易于在界面膜中吸附形成较为致密的排位，因此其乳化力较高，在吸湿保湿方面改性后的羟丙基壳聚糖的吸湿率和保湿率甚至超过了透明质酸和甘油。

1.2.3.4 其他

由于羟丙基壳聚糖具有吸附性，相比于壳聚糖，其具有更广泛的pH使用范围，羟丙基壳聚糖还可用于工业废水处理，汪婷^[27]等制备出羟丙基壳聚糖纳米微粒并研究其对Ni² 的吸附作用，结果表明羟丙基壳聚糖纳米微粒对Ni² 的吸附能力比壳聚糖、羟丙基壳聚糖强，且在较苛刻的酸性环境中仍起到较好的吸附作用，在使用H₂SO₄作为脱附剂时，只需要30 min就能达到87%以上的脱附率。

1.3 丝素肽概述

丝素肽（SFP）是丝素蛋白水解后的产物，具有独特的抗氧化、降低胆固醇等性能，丝素肽在功能性食品、医药和化妆品等领域具有很大的潜力。丝素肽作为小分子肽更容易被人体吸收，更适合在保健食品上的开发与应用^[28]。丝素肽的制备原料主要为废丝或茧壳，通过脱胶处理、水解、除盐、脱色、过滤、干燥最终得到丝素肽^[29]。

丝素肽为可溶性丝蛋白，分子量在3000左右，其分子构象为无规卷曲结构，内含十多种氨基酸，极易被皮肤所吸收，能促进细胞的新陈代谢，丝素肽还具有天然调湿因子，能使皮肤角质层保持一定水分，还能有效抑制皮肤中黑色素的生成，且丝素肽经过对动物的皮肤、眼结膜刺激试验和动物的口服毒性试验，结果表明丝素肽作为化妆品原料的安全性是完全可靠的^[30]。在八十年代，江苏无锡、苏州、浙江的山东就有工厂将丝素肽加入到膏药中，提升其保湿、愈合性能，常用到劳保用品中^[31]。

1.4 转谷氨酰胺酶概述

“21世纪超级粘合剂”——转谷氨酰胺酶（Transglutaminase, 简称TGase或TG），学名谷氨酰胺转氨酶，它可以通过催化蛋白质分子内谷氨酰氨基的水解、蛋白质分子内或分子间的交联以及蛋白质和氨基酸之间的链接，来改变蛋白质的结构，从而改善蛋白质功能特性。广泛应用于化妆品、纺织、医药和功能性食品等领域^[32]。

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