1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文献综述
发酵工业是现代工业的重要组成部分，支撑着几百种工业产品和价值几十亿美元的工业产值。由鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)发酵生产的微生物多糖#8212;#8212;威兰胶是一种重要的工业产品，作为乳化剂、悬浮剂、增稠剂、防冻剂等应用于食品工业、石油化工、工业废水处理等方面^[1]。然而，威兰胶生产过程中面临多种非生理条件胁迫，如微生物代谢热、机械搅拌热导致的高温胁迫，代谢产物积累导致的酸碱胁迫，高密度发酵带来的传质效率降低等，严重限制了威兰胶产量的提高以及生产成本的降低^[1][2]。
目前提高微生物抗逆性能的方法主要有：诱变育种、长期适应性进化、表达抗逆元件（尤其是来源于极端微生物的元件）等技术^[3]。但是，诱变育种和长期适应性进化存在突变方向和性质难以掌握，突变体难以集中多个理想性状，筛选工作量大，优良性状难以传代等缺陷。因此，应用基因工程手段，筛选鞘氨醇单胞菌适用的抗逆元件成为本研究的主要内容。
1.威兰胶简介
鞘氨醇单胞菌的重要用途之一是作为威兰胶的生产菌株，威兰胶是一种新型微生物多糖，是美国 Kelco公司 80年代继黄原胶、结冷胶之后开发的最有市场前景的微生物多糖之一, 迄今为止美国的 Kelco公司是威兰胶全球唯一的生产、供应商[4]。
由于威兰胶的剪切稀化作用及其优良的流变性能, 它主要作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂、成膜剂和黏合剂应用于工农业的各个方面。特别是在食品、混凝土、石油、油墨等工业中有广泛的应用前景。在食品工业方面,威兰胶在烘焙制品、乳制品、果汁、牛奶饮料、糖衣、糖霜、果酱、肉制品和各种甜点的加工中有潜在的应用价值。在石油工业中, 威兰胶可用于调配钻井泥浆, 以保持水基钻井液的黏度和控制其流变性能。威兰胶还是一种新型的驱油剂,用于油井的三次采油, 将威兰胶调配成适合浓度的水溶液注入井内, 压进油层驱油, 可大大提高采油率。威兰胶具有的耐高温性和极好的耐酸碱和抗盐性能，在石油开采工业中发挥着不可替代的作用[4][5]。威兰胶也可广泛应用于水泥和混凝土中, 它能够增强泥浆的保水性, 当它作为保水剂时不需要像其它的添加剂那样使用分散剂。与其它添加剂相比, 较低浓度的威兰胶就可以取得很好的效果。
2.威兰胶生产中存在的问题
威兰胶生产过程中仍存在许多限制性因素，影响其生产效率，造成成本居高不下以及对资源的严重浪费。
(1) 威兰胶生产菌株最适生长温度为30 ℃，由于生长温度限制，目前工业生产需要控制发酵体系温度为30 ℃。工业发酵罐体积达到300-400立方米，生物代谢热和机械搅拌热致使发酵体系不断升温，菌株无法自行降到代谢最适温度，需要消耗大量冷却水控温，导致能耗费用增加，消耗约20%左右发酵总成本。据计算，发酵温度每升高5 ℃，年产万吨威兰胶生产企业一年可以降低5亿元的生产成本。此外我国大部分地区夏季环境温度达到30 ℃以上，通过冷却水控制发酵体系温度维持在30 ℃基本不可行，体系温度往往高于30 ℃，超过菌株的耐受极限，菌株不能正常生长甚至死亡，无法代谢合成威兰胶，造成生产企业整个季度停产[6]。
(2) 威兰胶合成为高耗氧发酵过程，溶氧对菌株生长以及威兰胶的合成具有极其重要的意义。溶氧对多糖发酵的影响主要有两点：首先是氧直接参与了多糖产物的合成[18]，另一点是溶氧通过影响包括呼吸链有关的能量代谢从而影响微生物生长。随着威兰胶产量的积累，发酵液呈现高粘度（~3.5 Pa s）特性，严重限制了氧传递效率[7][8]。目前提高溶氧的操作主要集中在增加通气量和提高搅拌速率，但是高通气量和搅拌速率将直接增加生产成本，同时对敏感的菌体产生机械损伤。朱萍等通过添加氧载体的方式提高发酵体系的溶氧水平，使得生物量和威兰胶产量获得一定程度的提高。然而，氧载体过高的价格限制了其大规模的工业应用。
(3) 威兰胶合成的最适pH值为7.4 - 7.6，由于酸性多糖威兰胶浓度的更加，发酵中后期pH下降为4左右[9]，对菌体产生抑制作用。大量碱液的加入增加了额外的经济成本，不符合绿色化学的要求。
这些问题一直阻碍着威兰胶大规模工业化生产。因此解决以上问题，实现低成本、低能耗、高效率威兰胶发酵生产具有极其重要的实践与理论指导意义。
3.抗逆基因元件的挖掘与应用
面对环境压力，微生物在长期进化过程中，产生了多种自我保护机制。近年来，许多研究学者对抗逆微生物进行了深入研究，而微生物体内存在的多种抗逆机制的阐明，也使提高工业和环境微生物的抗逆性成为了可能。通过分子操作技术，过量表达自身或者异源调控因子或者抗逆基因能够显著提高菌株耐受环境压力的能力[10]。
热休克蛋白(heat shock protein)是一种分子伴侣，参与蛋白的正确折叠、聚合、转运和信号传递等重要生理过程，它们的大量合成可保证在应激条件下细胞的存活。在环境温度明显改变或有重金属、毒性化合物以及致病微生物感染等不利条件下，热休克蛋白合成会显著增加[11]，否则将导致细胞的不可逆损伤并导致死亡。研究报道，在大肠杆菌中过表达同源热休克蛋白GroESL可显著提高宿主对乙醇、丁醇、1，2，4-丁三醇的耐受性[11][12]。此外，本课题组前期将突变的热休克蛋白DnaJ和Clp共表达在威兰胶生产菌株中，菌株温度和酸碱耐受性均有所提高。
基因转录水平调节是微生物为了维持正常细胞活动以及应对环境变化必不可少调控机制。转录调控因子（transcriptional regulators）通过调节基因表达、修复DNA或蛋白质大分子、促进形成生物膜等途径影响一系列生物途径[13]，在微生物生长代谢中起到了至关重要的作用，操作此类调节因子，使其在微生物中发挥调控作用，能够增强微生物的抗逆性。通过复杂但是高效的转录调控网络，微生物可以外界环境压力（如pH、温度、营养物质、渗透压等）及时做出响应，并优化代谢强度来适应新的环境[14][15]。近年来，许多课题组试图通过对转录调控蛋白的改造直接或间接的操控转录调控网络，以达到提高菌株抗逆性的目的。
由于在极端环境下的长期适应性进化，极端微生物具有明显优于其他菌株的抗逆性能。利用分子生物学手段将来源于极端微生物的热休克蛋白或转录调控因子应用于工业微生物耐受性能改造具有更显著的效果。因此，筛选并表达极端微生物中的热休克蛋白来提高威兰胶生产菌株的抗逆性能具有理论可行性。

参考文献：
（1）台喜生，冯佳丽，李 梅，李师翁.鞘氨醇单胞菌在生物降解方面的研究进展[J]. 湖南农业科学 2011，（7）：21~25.
（2）胡 杰,何晓红,李大平 刘 强. 鞘氨醇单胞菌研究进展[J]. 应用与环境生物学报 2007, 13( 3): 431~ 437
（3）Hsu C, Lo Y M. Characterization of xanthan gum biosynthesis in a centrifugal, packed-bed reactor using metabolic flux analysis [J]. Process Biochemistry. 2003, 38(11): 1617-1625.
（4）Jansson P, Widmalm G. Welan gum (S-130) contains repeating units with randomly distributed L-mannosyl and L-rhamnosyl terminal groups, as determined by FABMS [J]. Carbohydrate Research. 1994, 256(2): 327-330.
（5）董学前,刘元涛,王伟,张永刚,武琳,吉武科,刘建军. 鞘氨醇单胞菌发酵生产威兰胶的研究. 发酵科技通讯,2015年11月.
（6）FIALHO A M, MOREIRA L M, GRANJA A T, et al. Occur-rence, production, and applications of gellan: current state and perspectives[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008,79(6): 889-900.
（7）AI Hongxia, LIU Min, YU Pingru, et al. Improved welan gum production by Alcaligenes sp. ATCC31555 from pretreated cane molasses[J]. Carbohydrate Polymers, 2015, 129: 35-43.
（8）Yu H, Gerstein M. Genomic analysis of the hierarchical structure of regulatory networks [J]. PNAS. 2006, 103(40): 14724-14731.
（9）朱萍. 高产威兰胶的温度耐受型菌株选育与耐受机制研究高产威兰胶温度耐受性菌株选育与耐受机制研究 [Z]. 2015.
（10）郭建军, 李建科, 陈芳, 赵燕, 霍树春, 高炜丽. 威兰胶的特性、生产和应用研究进展.中国食品添加剂.
（11）Hamdy A H A, Nguyen B H, Victor W, et al. Two Angular Dioxygenases Contribute to the Metabolic Versatility of Dibenzo－furan-Degrading Rhodococcus sp. Strain HAO1 [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74（12）：3812-38.
（12）Li D, Yang F, Lu B, et al. Thermotolerance and molecular chaperone function of the small heat shock protein HSP20 from hyperthermophilic archaeon, Sulfolobus solfataricus P2 [J]. Cell Stress and Chaperones. 2012, 17(1): 103-108.
（13）孙翔英，刘月芹，孙欢，等. 大肠杆菌耐热元器件的构建及其应用 [J]. 化工学报. 2014(08): 3128-3135.
（14）Podar M, Reysenbach A. New opportunities revealed by biotechnological explorations of extremophiles [J]. Curr. Opin. Biotechnol. 2006, 3(17): 250-255.
（15）Gao C, Jiang B, Wang Y, et al. Overexpression of a heat shock protein (ThHSP18.3) from Tamarix hispida confers stress tolerance to yeast [J]. Molecular Biology Reports. 2012, 39(4): 4889-4897.

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

主要研究问题
针对威兰胶生产过程中代谢热、搅拌热导致的高温胁迫以及酸性代谢产物积累导致的逆境胁迫，筛选与温度耐受性、酸耐受性相关的抗逆元件，实现对菌株抗逆性的精确调控。

拟采用的研究手段
一、利用分子生物学手段得到抗逆基因原件并构建表达载体；
二、利用三亲本接合的方法转化入威兰胶生产菌株中，得到重组菌株；
三、重组菌株的生长特性及威兰胶产量的验证。