文 献 综 述

摘要：海藻糖合成酶能够以麦芽糖为底物，通过催化分子内转糖基将α,α-1,4糖苷键转变为α,α-1,1糖苷键，把麦芽糖转变成海藻糖，可应用于工业化生产海藻糖。本课题通过对来自弯曲高温单孢菌的海藻糖合成酶蛋白的表达、纯化和结晶，利用X射线衍射技术对此酶结构进行解析，为后面对此酶的分子改造提供信息支持，从而达到提高此海藻糖合成酶转化麦芽糖反应中的目标产物的得率并降低副产物得率的目的，从而在工业上可以降低海藻糖的生产成本。

关键词：海藻糖合成酶；X射线衍射；结构

海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖。海藻糖是一种具有重要生物学意义的非还原二糖，广泛存在于多种生物体内。由于海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下能在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，因此在科学界素有”生命之糖”的美誉。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，具有广阔的市场前景和应用价值。目前，在所有生产海藻糖的方法中，路线最简单的工艺是：海藻糖合成酶（Trehalose synthase，TreS）以麦芽糖为底物，通过分子内转糖基一步催化反应生成海藻糖。这种方法的关键在于具有高转化率的海藻糖合酶。目前，虽然已有多种不同微生物来源的海藻糖合酶被研究和应用，但只有少数具有工业化的潜力，其主要的原因是海藻糖合成酶转化率低，温度、pH耐受性差，副产物得率高。

海藻糖合成酶最初由Tsusaki发现存在于脂肪肝菌Pimelobacter sp.R48中，随后，被发现存在于越来越多的微生物中，主要为细菌和古生菌，包括：耻垢分支杆菌Mycobacterium smegmatis、嗜热裂孢菌Thermobifida fusca、施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri、嗜酸菌Picrophilus torridus、嗜热栖热菌Thermus thermophilus、耐辐射奇异球菌Deinococcus radiodurans、金黄节杆菌Arthrobacter aurescens、霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei、红色亚栖热菌Meiothermus ruber、谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium glutamicum、地热奇异球菌Deinococcus geothermalis、弯曲高温单孢菌 Thermomonospora curvata、混浊红球菌Rhodococcus opacus等。

通过对不同来源海藻糖合成酶序列同源性分析发现，海藻糖合成酶是糖基水解酶13家族（Glycoside hydrolase family 13，简称Family GH l3，也称α-淀粉酶家族）成员之一。Stam等将其列为Family GH l3的16亚族（GHl3-16 subfamily，麦芽糖葡萄糖基转移酶亚族）和33亚族（GHl3-33 subfamily，海藻糖合成酶亚族）。

目前发现的海藻糖合成酶催化时都会产生不同程度的葡萄糖。Yue等通过对Enterobacter hormaechei海藻糖合成酶的研究发现，催化中生成葡萄糖的量随着温度的升高逐渐增加。但是Lee等在施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri CJ38中发现了一种新型海藻糖合成酶（PsTs），在催化麦芽糖生成海藻糖的过程中没有任何葡萄糖生成，通过氨基酸序列对比发现，PsTS氨基酸序列与其他海藻糖合成酶相似性很低，由于海藻糖合成酶分子结构和催化机理了解不清晰，不能解释其原因，但是这个发现为减少葡萄糖生成，提高海藻糖合成酶的转化率提供了有效的理论基础。

海藻糖合酶催化麦芽糖和海藻糖相互转化的可逆反应，麦芽糖和海藻糖都可以作为海藻糖合酶的底物，Pan等人通过对耻垢分枝杆菌海藻糖合酶催化机制的研究，提出该海藻糖合酶具有两个不同的底物结合位点，分别结合麦芽糖和海藻糖。因为在高浓度无放射性标的海藻糖存在下,该酶仍能以[¹⁴C]标记的麦芽糖为底物，生成具有放射性的海藻糖。如果麦芽糖与海藻糖结合位点相同，高浓度的海藻糖会竞争性结合于酶活中心，从而阻遏麦芽糖与酶的结合。海藻糖合酶以麦芽糖为底物涉及a-1,4糖苷键的断裂，而以海藻糖为底物需要a-1,1糖苷键的断裂，其酶催化机制可能并不相同，这也说明在海藻糖合酶可能存在两个底物结合位点，分别结合麦芽糖和海藻糖。