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基于数字微镜器件的三维随机访问成像的双光子显微镜

QIANG GENG,1 CHENGLIN GU,1,2 JIYI CHENG,1 AND SHIH-CHI CHEN1,*
1Department of Mechanical and Automation Engineering, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, Hong Kong, China
2State Key Laboratory of Precision Spectroscopy, East China Normal University, Shanghai, China
*Corresponding author: scchen@mae.cuhk.edu.hk
Received 30 March 2017; revised 17 May 2017; accepted 18 May 2017 (Doc. ID 291783); published 15 June 2017

快速3D显微成像方法已经在许多生物学研究一直发挥着至关重要的作用。在这快报中，我们提出了一种革命性的方法来设计和构建基于数字微镜器件（DMD）的3D随机访问成像的双光子激发（TPE）显微镜，实现22.7 kHz的扫描速度。当与40times;物镜配对时，x，y，z轴的最大扫描范围分别为103,206,524。轴向和横向扫描分辨率（即，最小步长）分别为270nm和130nm。在该系统中，通过切换存储在DMD中的二进制全息图，飞秒激光的焦点可以任意地定位到空间中的任何随机点。导出参数模型以确定性地将DMD参数（即，像素大小和孔径）与扫描仪特性（即，每个轴中的扫描范围和最小步长）相关联。在实验中，我们展示了传统的光栅扫描，沿着任意编程的表面扫描，以及通过基于DMD的TPE系统对花粉粒样品的随机访问扫描。我们还进行实验以证明选择性光学刺激的独特能力，其中通过延长激光停留时间使样品内的选定位置光漂白。凭借其多功能性和高扫描速率，TPE显微镜可以在大脑研究中找到重要的应用，实现体内随机访问成像和具有数十微秒时间分辨率的光学刺激。copy;2017美国光学学会

对脑和神经元活动的研究需要新的成像技术，即随机访问显微镜，其可以实现具有高空间和时间分辨率的3D成像。随机访问显微镜首先被开发用于捕获几毫秒范围内的高速生物事件，例如神经回路的尖峰，这是典型的光栅扫描系统无法实现的[1,2]。典型的3D随机访问显微镜采用四个声光偏转器（AODs），以10 -100 kHz的速度任意访问工作体积内的任何点[3,4]。由于具有出色的速度，随机访问显微镜可以最大化选定区域的扫描时间，从而在比光栅扫描系统高得多的帧速率下实现更好的信噪比。尽管基于AOD的扫描方法很快（几十千赫兹），但是当焦点扫描远离原始焦平面时，分辨率通常会受到影响[3]; 此外，点扩散函数（PSF）（～3-10mu;m）[4]的大纵向尺寸使其不适合立体扫描。已经开发了多种方法来克服这些问题，例如，通过横向和轴向扫描路径的分离，最小化AOD之间的干扰[4]，以及高带宽定制AOD与高性能控制系统的结合应用[5]。这些系统复杂且昂贵，并且需要同步四个AOD; 通常需要额外的棱镜对来补偿来自AOD的严重时间分散，使得它们难以使用和维护。尚未开发出来一种紧凑，低成本，多功能的具有与光栅扫描系统相当的分辨率的随机访问成像系统。

在这快报中，我们提出了一种革命性的方法来设计和构建用于随机访问和3D成像的双光子激发（TPE）显微镜以及基于单个数字微镜器件（DMD）的选择性光学刺激。TPE显微镜的扫描速率为22.7 kHz，其中x，y，z轴的最大扫描范围分别为103,206,524mu;m。 轴向和横向扫描分辨率（即，最小步长）分别为270nm和130nm。此前，我们已经展示了使用DMD和二进制全息术的高速飞秒激光束整形和轴向扫描[6,7]。这项工作建立在之前的工作基础之上，它将扫描能力扩展到包括整个3D空间，通过叠加和快速调制DMD上设计的二进制全息图实现同步轴向和横向扫描。由于每个全息图对应于空间中的特定点，因此DMD扫描仪可以以相同的速度将焦点移动到其工作体积范围内的任何随机位置，从而实现随机访问成像。

基于DMD的TPE显微镜的光学配置如图1所示。激光源是Ti：蓝宝石飞秒激光器（Chameleon Ultra II，Coherent），重复频率为80 MHz，平均功率为3.3 W; 激光器在800nm的中心波长下工作，脉冲持续时间为200fs，光束直径为2.5mm。首先，输入激光束通过L1和L2扩展以填充DMD孔径（DLP 4100 0.7#39;#39;XGA，Texas Instruments）。 由于DMD既可以作为可编程二进制全息图，也可以作为闪耀光栅，它可以为激光束引入负角色散。为了消除角度色散，在光路中包括闪耀透射光栅（1200 lines/mm, Lightsmyth）和反射镜（M1）以产生正角度色散。 在DMD之后，通过由消色差透镜L5和管透镜L6组成的1：1望远镜将无色散激光束引导至无限远校正的40times;物镜（CFI Apo LWD N.A.1.15，Nikon）。虹膜光阑放置在L5的后焦平面上，以在空间上排除除全息图的-1级衍射之外的所有衍射光束。在物镜和L6之间，安装了长通分色镜，以将样品的发射引导到光电倍增管（PMT）（R10699和C7950，Hamamatsu），它与DMD触发信号同步。最后，数据采集卡收集并处理PMT信号以形成3D图像。这些操作由自定义开发的LabVIEW程序完全自动化。

沿光轴（即z轴）的轴向扫描是通过应用增加或减少焦距的球面波前的二进制全息图来实现的[7]：

其中lambda;是波长，f是球面波前的焦距。 公式(1)中球面波前的二进制全息图是基于Lee全息术[8,9]生成的，可以计算为

其中, 1g，表示DMD上的像素; 1和0分别表示“开”和“关”状态;和分别表示行数和列数;是全息图的光栅周期; 是整数; 是决定条纹宽度的常数。

通过改变倾斜相位项可以实现横向扫描，即，公式(2)中，其中， 确定条纹图案的倾斜角度，和确定条纹的周期。这可以在频域中更好地理解。x和y轴上条纹的空间频率,即分别是,，可以通过执行倾斜相位项的傅里叶变换来找到，即。图2说明了横向扫描过程。为了沿L5的焦平面沿的x轴扫描焦点，可以改变控制第-1和第0衍射级之间的间隔距离（或角度）的的值。请注意，除第-1个衍射级外，所有其他衍射光束都被空间滤波器阻挡。同样，沿y轴的横向扫描可以通过调整的值来实现，并且与其他轴的扫描控制无关。在选择操作参数时，值得注意的是，应避免分别使用和的小值或高值，因为它们可能导致衍射光束在空间中重叠或倾斜相位项超出公式(2)中不等式的范围，导致无调制。 结合上述轴向扫描方法，可以通过单个DMD实现3D随机访问扫描。由于DMD扫描仪能够扫描空间中的任意路径，因此可以在DMD平台上容易地实现所有传统扫描策略，例如光栅，螺旋或利萨如扫描轨迹。 另外，扫描路径上每个点的停留时间也可以任意控制，实现选择性光学刺激。

在本节中，我们提出了确定性地将DMD参数（即像素大小和孔径）与DMD扫描仪的特性（包括扫描范围和最小步长）相关联的参数模型。首先，我们考虑x方向上的最大扫描范围。让, 其中是x方向上每个光栅周期的像素数，是DMD像素尺寸。最大空间频率变化可表示为, 其中和分别是x方向上每个光栅周期的最小和最大像素数。对于我们的DMD，。考虑到激光束的入射角为45°，有效间距变为。根据图1中的几何关系，第-1级衍射角与物镜焦平面上的横向位移成正比，即, 其中是样品平面中的横向偏移，是物镜的放大倍数。根据光栅方程，我们可以得到x方向的横向扫描范围：

最大扫描范围（）可通过在等式（3）中设置和来计算。把DMD和透镜参数代入公式（3）中，得出。

图1基于DMD的TPE显微镜的光学配置，包括一个DMD;M1，M2，高反射镜; L1-L6，透镜;DM，二向色镜;PMT，光电倍增管。

图2 在L5的焦平面中进行横向扫描，其中通过改变空间频率来实现x轴扫描。 是0阶和-1阶衍射之间的衍射角。

接下来，我们推导出y方向的横向扫描范围。让;是y方向上每个光栅周期的像素数。由于沿y轴的横向扫描不受空间滤波器的约束，因此最大空间频率变化是x轴上的两倍，并且可以表示为, 其中是y方向上每个光栅周期的最小像素数。 按照相同的步骤，横向扫描范围Delta;y导出为

当时，发现y轴的最大横向扫描范围（）为。

轴向扫描范围由DMD的最大光功率确定，如公式（5）[7,10]所示，

其中是浸没介质的折射率，是每个光栅周期的像素数，即，。因此，当和均等于2时，最大轴向扫描范围计算为。请注意，不能同时实现面内和面外扫描的最大扫描范围。轴向扫描范围随横向焦移的增加而线性减小，并在x或y扫描范围结束时达到其最小值（）；DMD扫描仪的工作空间如图3所示。基于公式(3)-(5)，通过使用更多像素或更小像素尺寸的DMD，也可以实现更大的扫描范围。 例如，如果使用DLP 6500，工作量将增加16倍。接下来，我们考虑横向的最小步长。这里，假设DMD孔径被激光束完全填充，最小步长被定义为将导致一致步骤的的最小变化（即，）。当标题相位在DMD孔径的一半处（即，且）变化时，可以找到。把这些条件代入公式(2)中，我们得到

重新排列公式(6)，我们得到了。将该结果代入公式（3），得到x轴扫描的最小步长（），并用公式(7)表示。注意，y方向上的最小步长（）的表达式与公式(7)相同。

当，时，计算出系统的为～0.13。如[7]所述，DMD扫描仪的轴向扫描分辨率为～0.27。这些结果表明，基于DMD的TPE显微镜具有适当的扫描分辨率，可以在横向和轴向进行连续扫描。如公式（7）所示，使用更多像素的DMD可以进一步减小最小步长。

图3（a）DMD扫描仪工作空间的可视化图示：浅灰色体积和深灰色体积分别表示minus;1阶和 1阶衍射的工作空间。工作空间可以通过从立方体DMD工作空间（b）中减去圆锥体区域（c）得到。请注意，第0阶和第1阶衍射在锥体中重叠。

为了验证基于DMD的TPE显微镜的性能，我们对花粉粒样品（25，混合花粉粒，卡罗莱纳生物供应）进行了3D成像实验。 在第一个实验中，DMD被编程为执行光栅扫描，其中获得尺寸为30times;30times;40的单个花粉粒的体积图像。8万个二进制全息图自动生成并加载到DMD控制器的随机存取存储器（RAM）中，以执行任务。扫描频率为22.7kHz，整个体积成像过程在3.6s内完成。图4（a）-4（h）显示了花粉的八个横截面层的结果，其中可以清楚地看到谷粒上的单个尖峰。 每层具有100times;100像素并且相隔5。 从结果可以得出结论，基于DMD的系统的成像分辨率和光学横截面能力与传统的激光扫描TPE显微镜相当。

图4 由DMD扫描的八个不同深度的花粉粒的横截面图像; 比例尺为10。

图5 在任意编程的球面(a)-(c)和正弦曲面(d)-(f)上的两个选定花粉粒的横截面图像。

图6花粉粒上的随机访问成像实验：（a）花粉粒的8个成像层，其中在不同层选择6个带有颜色标记的远点; 比例尺为10; （b）所选点的记录电压（即荧光强度）; 颜色条将荧光数据与（a）中的特定点相关联。

为了证明扫描空间中任意路径的能力，我们在球形和正弦曲面上扫描两种不同的花粉粒。 结果如图5所示。（有关视频演示，请参见可视化1）。对于球面，扫描参数应满足面

资料编号：[3138]