文献综述

1.前言

维生素 C（Vitamin C, VC）是一种参与人体多种生理活动的水溶性维生素，它对维持人体健康的作用被广泛认可【1】。它能治疗坏血病，并且具有酸性，所以被称作抗坏血酸。抗坏血酸在食品、医疗、化妆品等行业上有广泛的应用价值,但由于自身的不稳定性,易被氧化降解,严重影响其应用。研究发现抗坏血酸的一种重要衍生物#8212;#8212;2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸（AA-2G）,作为抗坏血酸的替代品,稳定性显著提高,具有很好的开发应用价值【2】。AA-2G 的化学合成法非常困难且成本高，目前应用最广泛的是生物合成法，当前已被报道的用于AA-2G合成的酶包括了α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、蔗糖磷酸酶（Sucrose phosphorylase,SPase）、α- 异麦芽糖基葡糖基糖合成酶【2】、环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)和葡聚糖蔗糖酶【3】。目前广泛使用的酶是环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)。但是以相对便宜的蔗糖为糖基供体合成 AA-2G，同时优化反应条件，可以降低生产成本，同时提高 AA-2G的收率，进行大量工业化生产。全细胞催化是利用完整细胞进行生物转化的技术。用全细胞催化技术的一个重要优点是，能通过对宿主细胞的分子改造或代谢调控，无需对酶分离纯化，减少了酶活损失，同时因有细胞保护，酶稳定性更好，半衰期更长，细胞易于与产物分离并回收，可以实现催化剂的重复使用，降低了生产的成本【4】。

2.AA-2G的合成原理

根据相关文献报道，酶法转化法是合成AA-2G的唯一方式，Vc糖基供体在糖基转移酶的作用下，发生糖基转移反应生成Vc衍生物AA-2G和AA-2Gn(n=2，3，4，5，6)的混合物，混合物经糖化酶酶切生成AA-2G酶切副产物，最后分离纯化，结晶得到AA-2G。糖基供体可以提供葡萄糖基团，利用糖基转移酶的转糖基作用将葡萄糖基团连接到VC的C2位上，因连接的葡萄糖基链长短不同，获得的产物除AA-2G外，还有AA-2Gn(n=2，3，4，5，6)的混合物，添加葡萄糖淀粉酶可改变这些糖基链的聚合度，使AA-2Gn转变成AA-2G。由于Vc的5-C和6-C上也可以连接葡萄糖基团，因此还会有AA-5G或AA-6G副产物生成【5】。

3.广泛使用的合成AA-2G的方法

目前广泛使用的酶是环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)，即利用 α-环糊精葡萄糖基转移酶等糖基转移酶将供体上的D-吡喃 葡 萄糖 基 转 移 到 VC 的 2-碳 位 羟 基 集 团，脱 水 生 成AA-2G。α-环糊精葡萄糖基转移酶 ( α-Cyclodextrin Glycosyltransferase，α-CGTase) 是糖基水解酶 α-淀粉酶家族 13 成员，是一种微生物所产的胞外酶【6】。可以催化 4 种不同的反应，包括3 种转糖基化反应( 歧化反应、环化反应、偶合反应) 和水解反应【7】，其中环化反应是 α-CGTase 的特征反应，制备 AA-2G 也是利用此特征反应。α-CGTase 是 AA-2G 制备中最关键的一种酶，但目前市场上该酶价格昂贵。在通过构建大肠杆菌分泌表达系统，制备可溶性 α-CGTase，并利用该酶及淀粉制备 AA-2G，以降低生产成本。

4.蔗糖磷酸化酶

蔗糖磷酸化酶 (EC2.4.1.7 ， Sucrose phosphorylase，SPase) 属于糖基水解酶 13 家族，是一种催化转移葡萄糖苷键的酶，能够催化蔗糖和无机磷酸盐合成 1-磷酸-葡萄糖【8-9】。该酶主要以蔗糖、1-磷酸-葡萄糖为供体，多类物质如多羟基的糖和糖醇、酚羟基、羧基等为受体，催化合成各种糖苷【10】。通过生物发酵获得，但由于产量和生产效率都比较低，因此通过基因工程手段构建重组菌株，过量表达蔗糖磷酸化酶对于进行工业化大量生产十分必要。目前 AA-2G 生产的成本较高，一个原因是酶的制备和使用较困难。大部分用于合成 AA-2G 的酶是游离酶，反应后难以回收利用或从产物中去除。同时制备时需要菌体破碎或粗酶液的浓缩、纯化等繁琐的操作【11】。针对游离酶的这些问题，对酶进行固定化或使用完整细胞是重要的解决方法【12-13】。AA-2G 生产的成本高的另一个原因是目前广泛使用的CGTase 造成的，适合它的糖基供体价格较高。。当以较昂贵的α- 环糊精作为底物时，AA-2G 的产量较高。而CGTase 利用便宜的底物得到的 AA-2G 产量则非常低，即使经过了分子改造【14】，产量依然不理想。以麦芽糊精为底物，AA-2G产量普遍在 2 g/L左右；以麦芽糖为底物，AA-2G 产量为 5.5g/L【15】和可溶性淀粉 AA-2G 产量为 2 到 3 g/L【16-18】。Kwon【19-20】首次证明了 SPase 可以合成 AA-2G，却未进行反应条件优化方面的研究。相信以 SPase 为催化剂，使用较便宜的蔗糖为底物，优化了反应条件后 AA-2G 将会提高产量。在 AA-2G 的合成反应中，pH 有重大影响，一个原因是因为底物 VC 在中性和碱性条件下很容易氧化分解。在优化合成时要对反应ph进行研究，探求最适ph【21】。SPase 能以蔗糖为糖基供体，将蔗糖的葡萄糖基转移到种类众多的含羟基的受体上，而应用其以 VC 作为受体合成AA-2G 的研究才刚刚展开。

5.利用基因工程微生物进行全细胞催化反应