1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

大肠杆菌的argE基因编码N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶(N-acetylomithine deacetylase，NAOase，EC3．5．1．16)，可选择性的作用于L-型酰基化氨基酸，NAOase具有广泛的底物特异性，可立体拆分消旋化氨基酸生成L-氨基酸，可作为一种新型的手性拆分酶源。NAOase是原核生物精氨酸合成代谢中的关键酶，产物鸟氨酸是多胺类物质合成的前体。多胺与DNA复制及细胞分裂有关，因此NAOase的活性对细菌繁殖必不可少。而真核生物不含NAOase，故可以argE编码的NAOase为作用靶标来研究新型抗生素，本文主要研究NAOase的高效表达与纯化。

1 N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的来源与作用

从微生物中，从谷氨酸到精氨酸的生物合成途径包括8个酶催化反应步骤[1]。第五步反应，不同的菌种采用不同的酶催化N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶（N-acetylornithinedeacetylase，简称NAOase；EC3.5.1.16）。1953年，Henry 等阐明了E. coli. 内鸟氨酸的生成途径，即从谷氨酸开始经乙酰谷氨酸、乙酰谷氨酸半醛到乙酰鸟氨酸，乙酰鸟氨酸再脱酰基生成L-鸟氨酸。此反应途径也是E. coli. 内鸟氨酸合成的唯一途径。不同的菌种采用不同的酶催化N-乙酰鸟氨酸脱去乙酰基，例如在链球菌属及红面包霉菌中是由鸟氨酸乙酰转移酶（Ornithine acetyltransferase，EC 2.3.1.35）将乙酰基转移给谷氨酸，产生鸟氨酸和乙酰谷氨酸。

催化乙酰鸟氨酸脱酰基的酶兼具乙酰酶和肽酶的活性，呈现出转氨酶的活性。早在1956年，Bonner等人在大肠杆菌中发现了N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的存在[2]。催化的反应式为：

他们对酶简单纯化后，初步研究酶的生化性质，提出Co2 和谷光甘肽对酶有促进作用，而Cu2 、Zn2 、Ni2 、EDTA和对氯高汞苯甲酸盐对该酶有抑制作用。此外，他们还研究了该酶的底物特异性，证实该酶不仅可以催化乙酰鸟氨酸，还可催化乙酰丙氨酸、乙酰亮氨酸、乙酰甲硫氨酸等其它酰基化的氨基酸。

随着分子生物学和基因工程的快速发展，迄今为止，已经在细菌、真菌、霉菌等多种微生物中以及动植物中鉴定出了N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶。Thierry Meinnel等于1992年首次从大肠杆菌中分离得到argE基因[3]，经分析该基因全长1400 bp，编码42350u的多肽链。在大肠杆菌基因图谱中显示oxyR为argE基因的表达操纵子。研究发现序列中有三个可能的起始密码子，经突变技术确定第三个ATG是表达argE基因的起始密码子。除这以外，还发现广泛存在的两种等位基因，一种是在AB1157菌株中发现的等位基因argE3，它是一种赭石型突变[4]；另一种等位基因来自于菌株XA100，它是一种琥珀型突变[5]。此研究从遗传学角度揭示基因序列，为进一步研究该酶催化机制及其结构奠定良好基础。

2 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的酶学性质

从的结构式可以看出，它是一种含金属锌的酶，有两个相同的亚基组成。根据氨基酸的序列，每个亚基的分子量为42350D。在进化同源性上，该酶与三种已知的具有氨基酰化酶活力的酶有很高的序列同源性及相似的生化性质[5]。它们是来自E.coli中由dapE编码的琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰酶、假单胞菌中由cpg2编码的羧肽酶G2以及猪肾脏中由aacⅠ编码的氨基酰化酶Ⅰ。这些水解酶均是含有金属Zn的酶，并且它们的亚基分子量很相近，约43Kda左右且都只能水解α-N-酰基-L-氨基酸。

1997年，Rowsell等得到了羧肽酶G2的三维结构[6]。经解析，该酶含有3个二硫键，活性部位有两个Zn（Ⅱ），每一个Zn离子与一个组氨酸残基、一个谷氨酸残基、一个天冬氨酸残基及一分子的水相结合。而这些关键的氨基酸残基同样存在于argE、dapE编码的蛋白质氨基酸序列中。这为研究乙酰鸟氨酸脱酰基酶的结构及功能又提供了有力的依据。

Farah等还对该酶的底物特异性进行详细的研究，进一步研究发现该酶具有很强的立体异构性。它只能作用于α-N-酰基-L-氨基酸，而不能水解N-乙酰-D-氨基酸和芳香族氨基酸及酸性氨基酸。相反，带有正电荷的侧链是N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶较好的底物。

3 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的应用

3.1.N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶在氨基酸拆分中的应用

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶是一种较为有效地拆分手性氨基酸的酶，可利用它专一的水解性，水解L-氨基酸酰化物的酰胺键生成L-氨基酸，未被水解的D-氨基酸酰化物与L-氨基酸分离后，可进一步水解成D-氨基酸，或者将其外消旋化后再进行手性拆分。这样大大提高拆分效率。1957年Chibata等首先发现米曲霉在发酵过程中可分泌氨基酰化酶代替从动植物组织中提取氨基酰化酶的方法[7]。1969年，千钿一朗等通过离子交换法将氨基酰化酶固定在DEAE-Sephadose载体上，他们制备的固定化氨基酰化酶活性高、稳定性好，可用于连续拆分DL-氨基酸[8]。此后不断有人退出氨基酰化酶新的研究成果[9-12]。国外主要是从米曲霉、猪肾等生物材料提取氨基酰化酶并将其固定化后用于酶法拆分手性氨基酸[13]。N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶来源于大肠杆菌具有拆分消旋氨基酸的特性，但其比从米曲霉、猪肾等生物材料中提取周期短、酶活力高、生产成本低等优点。有了N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶，还可利用生物信息学及分子生物学技术对酶进行定向进化，改变其底物专一性。

3.2.N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶在农林业上的应用

根据报道，Chen X等发现利用大肠杆菌中argE编码的基因工程菌可以选择性的除去草坪中的杂草[14]。黑麦草是重要的应用广泛的禾本科牧草之一，一般适合生长在寒冷的季节。狗牙根是越年生草本，适合生长在较温暖的季节。高尔夫球场草坪常年都绿，常将多年生黑麦草与狗牙根交叉播种。但是当狗牙根开始生长变绿时，很难除去常年生黑麦草。一种理想的方案就是当不需要常年生黑麦草时，能够选择性地将其作为杂草除去[15]。

3.3.N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶在医药领域的应用

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶在大肠杆菌体内的反应是精氨酸和多胺类物质合成的分支反应。由于真核生物合成精氨酸的途径和原核生物不同，故有可能据此研制出只作用于argE基因及其编码N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的全新型抗生素[16]，而对真核生物没有影响。多胺和DNA复制及细胞分裂有关，故N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的活性对细菌繁殖必不可少。在致病菌耐药性逐步提高的今天，这种广谱性抗生素的寻找和发现具有重要的医药应用价值[17]

4 基因重组蛋白的分离纯化

酶的化学本质是蛋白质，故蛋白质的分离纯化方法一般适用于酶的分离纯化。可作为纯化依据的蛋白质性质包括：大小、形状、电荷、等电点、疏水性、溶解度、配基结合能力以及基因工程构建的纯化标记等。用于酶分离纯化的方法可概括为下表[18]

表1-2 酶分离纯化的方法

Table 1-2 Methods of enzyme

据已有的文献报道，国外大多采用阴离子交换柱或亲、色谱法、亲和层析作为酶纯化层析方法。本实验室曾采用的填料为共价耦连的次氨基三乙酸使Ni2 固定化，即采用Ni-NTA树脂亲和层析分离带His标签的目的蛋白。

据统计，基因工程产品的分离 纯化成本约占到其全部成本的60%～80%。最常见的分离方法为即离子交换层析法（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）。离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。该方法主要运用于生物分子的分离纯化，如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。本实验采用弱阴离子与强阴离子组合纯化该酶，该方法未见报道。

5 金属酶中的离子含量测定

常用的光学检测法是紫外可见、荧光以及化学发光检测、电化学检测器、毛细管电泳、质谱检测，大多数有关电化学检测的报道是关于合理设计与毛细管电泳匹配的电化学检测池以及对电化学检测器性能进行评价的研究结果[ 19～22]。与毛细管电泳联用的主要质谱检测法是电感耦合等离子质谱 ( ICP2MS)、软电离的电喷雾质谱 ( ESI2MS)以及离子喷雾质谱 ( ISI2MS)。

光学检测因为大多数金属水合离子在 185nm以外的紫外区没有吸收或吸收极弱通常需要在背景电解质中加入辅助络合剂形成具有高吸光系数的络合物，以提高检测灵敏度。 ICP即电感耦合等离子体光谱仪，原理是由高频电流经感应线圈产生高频电磁场，使工作气体形成等离子体，并呈现火焰状放电，达到10000k的高温，是一个具有良好的蒸发-原子化-激发-电离性能的光谱光源。原子在高温下会发射出特征谱红线，根据特征谱线的强度可以对含量进行定量和定性的检测。

ICP检测能够高效准确的检测金属离子的含量，即使含有微量金属离子都可检测出来，所以本实验选用ICP检测酶内所含离子的量。

参考文献

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

（一）本课题的研究目的

n-乙酰鸟氨酸脱酰基酶来源于大肠杆菌，具有拆分外消旋氨基酸的特性。该酶在手性拆分、医药及农业领域中都有非常重要的实际应用价值。

国外主要对n-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的酶学性质、底物特异性及金属离子的影响作以简单的研究，国内主要研究了该酶的高效表达、纯化和复性，以及金属离子对该酶可溶性部分的酶活影响，而对该酶的具体催化机制、酶的构象、活性中心的研究较少。从整体来说，对该酶的具体催化机制和三维结构等都需要进一步的研究，目前尚未见发酵优化用于产业化应用的报道，也未见细胞破碎后酶活力的系统数据，国内外对naoase酶知之甚少，国内研究近似空白。