文 献 综 述

1 (R, R)- 2,3-丁二醇性质、应用、研究现状

2,3-丁二醇是一种重要的化工原料，广泛应用于化工、食品、燃料以及航空航天等多个领域，具有良好的应用前景[1]；同时，通过特定的化学反应，2,3-丁二醇可以衍生出多种重要的化学品如3-羟基丁酮 (又称乙偶姻，广泛应用于香料领域)[1]、甲乙酮 (优良溶剂)及1,3-丁二烯 （在合成橡胶、聚酯及聚亚胺酯等领域广泛应用）[2,3]，因此被视作一种极具潜力的平台化合物。2,3-丁二醇分子内含有两个手性碳原子，在精细化学品以及手性药物合成方面具有极其重要的应用价值。2,3-丁二醇存在三种立体异构体：(S, S)-2,3-丁二醇 (右旋型)、(R, R)-2,3-丁二醇 (左旋型)及meso-2,3-丁二醇 (内消旋型)，其结构如图1所示[4]。

图1 (R, R)-2,3-丁二醇立体异构体[1]

本课题研究的(R,R)-2,3-丁二醇体除了具有左旋型和内消旋型2,3-丁二醇的一般功能外，还具有一些特殊功能。首先，((R,R)-2,3-丁二醇由于存在不同的手性基团及空间构型，成为精细化学品、手性试剂及手性药物等高价值物质合成过程中的重要构件分子[5]。例如，(R, R)-2,3-丁二醇可用于合成药物阿司匹林的关键中间体丁三醇-对甲苯磺酸酯[6]，同时其还可以用于合成光学活性的2-甲基-1,4-丁二醇，2-甲基-1,4-丁二醇及其衍物是合成各种手性近晶型聚酯液晶材料及手性天然生物活性物质的重要中间体[7]；其次，(R, R)-2,3-丁二醇的凝固点低达-60℃，可作为优良的抗冻剂[8]；由此可见，光学纯(R,R)-2,3-丁二醇具有卓越的应用前景，但是如何专一并大量地生产高纯度的((R,R)-2,3-丁二醇立体异构体一直是阻碍其工业化生产的关键因素。

目前生物法生产(R,R)-2,3-丁二醇一般采用全细胞催化技术与合成生物学技术。2009年，Yan等[8]通过筛选四种次级醇脱氢酶 (sADH)对R-3-羟基丁酮的立体特异性，从中挑选出3种单一生成(R, R)-2,3-丁二醇的次级醇脱氢酶，然后以这三种酶基因为重要组成元件，分别在E. coli中构建(R, R)-2,3-丁二醇生物合成途径，对比三种工程菌发酵情况后，发现最高的目标产物浓度可达6.1 g/L (ee值gt;99%)，相对于葡萄糖的得率为0.31 g/g，这是目前报道最早的利用途径构建生产高纯度(R, R)-2,3-丁二醇的研究。2011年，Siemerink等[9]发现，丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株可生成S-3-羟基丁酮及R-3-羟基丁酮，但由于缺乏2,3-丁二醇脱氢酶而无法生成2,3-丁二醇，于是将拜氏梭菌 (C. beijerinckii) NCIMB 8052的3-羟基丁酮还原酶编码基因导入上述菌株中，最终由启动子Pthl控制的重组菌发酵得到1.98 g/L的(R, R)-2,3-丁二醇 (ee值为92%)，相对于葡萄糖的得率为0.034 g/g；而由另一启动子Padc控制的重组菌则经发酵得到(R, R)-2,3-丁二醇1.8 g/L (ee值为91%)，相对于葡萄糖的得率为0.033 g/g。虽然该研究得到的重组菌产(R, R)-2,3-丁二醇的能力较弱，但为产单一立体构型2,3-丁二醇异构体工程菌株宿主的选择提供了新的思路。

2 染色体水平生产(R, R)-2,3-丁二醇

在本实验前期的工作中，已经尝试利用合成生物学技术手段进行专一合成(R, R)-2,3丁二醇立体异构体菌株的构建，采用重叠延伸PCR的技术手段，将不同来源的微生物的基因元件实现了组装，并通过与质粒pTrc99a连接，构建了一条专一合成(R, R)-2,3丁二醇的代谢途径，初步发酵显示，该人工合成的代谢途径在大肠杆菌中显示出了较强的目标产物合成能力，光学纯度（对映体过量值ee）gt;99%，批次发酵产量达到了32 g/L。

然而，这种采用诱导型启动子和质粒过表达的方法对基因表达进行调控，来强化合成代谢途径中关键基因的表达，从而实现提高目标产品合成能力的策略，存在着诸多弊端。质粒介导的途径工程是短时表达重组基因的最好选择，尤其是用来高表达重组蛋白

时更是一个理想的选择。但是，对于多酶催化途径合成产物的研究来说，过强的表达基因对长期生产不利。此外，质粒不仅有着结构和分配的不稳定性、需要用选择标记来维持其在宿主细胞内的存在[10]，还会因为等位基因分离导致非生产质粒替代生产质

粒，从而引起质粒表达系统的不稳定[11]。更为重要的是质粒还会影响细胞代谢途径( 尤其是中心代谢途径)，除了会增加代谢负荷不利于菌体生长外，还会引起其他的生理变化，如增加氧摄取率和葡糖吸收、促进ATP 合成等[12,13]。因此，质粒介导的途径工程存在着影响遗传稳定性，进而影响重组途径的缺点，更为甚者还可能通过影响宿主细胞的全局转录网络而影响目标产物的合成。另外，采用诱导型启动子，需IPTG等添加昂贵的诱导剂，且无法精确调控表达强度。通过使用具有不同表达强度的人工调控元件，直接在染色体上对基因表达进行精确调控，可以很好地解决上述质粒过表达的问题。

在实验室前期研究的基础上，选用(R, R)-2,3-丁二醇生物合成途径中的三种关键酶基因:α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脱羧酶基因budA和(R, R)-2,3-丁二醇脱氢酶基因ydjL最为研究对象，在深刻理解多酶催化途径构建并稳定表达的理论基础上，发展一种精确调控上述三种基因表达强度的方法和一种染色体水平表达的技术，最终达到人工合成(R, R)-2,3-丁二醇代谢途径的多基因联合协同整合表达的目的。具体包括以下2个方面的研究内容：