文 献 综 述

海藻糖是一种非还原性二糖，是由2 个分子葡萄糖以α,α-1-1 键连接而成分子式为C12H22O11#183;2H2O ,化学性质极稳定,无毒无害,不会焦糖化。海藻糖广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及无脊椎动物中,既是一种贮藏性糖类,又是应激代谢的重要产物。它具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能。由于海藻糖具有广泛而独特的生物学功能,已被运用到医药业、化妆品业、食品加工业、农业等，受到各个国家的密切关注,以致引发了世界性的海藻糖研究和开发热潮，发展前景相当乐观，因此，把海藻糖的合成作为本次论文的主要内容。

含水结晶海藻糖的结构形式

目前生产海藻糖的方法有①天然生物提取法。许多生物体内都有海藻糖的存在，如动物、植物、微生物（霉菌、酵母菌、乳酸菌和其他一些真菌）都含有海藻糖，早在1832年Wiggers就从黑麦的麦角菌中分离到具有无色、非还原性、微甜的海藻糖结晶物。早期商品化的海藻糖是从酵母中提取的，主要方法有溶剂（三氯乙酸、热水、热乙醇等）抽提法、微波萃取法或高压处理法。但天然提取耗时较长，效率低，提取溶剂用量大，成本过高，使得海藻糖的产业化受到限制。②微生物发酵法。该方法是在一定的基质上培养微生物，通过微生物发酵产生海藻糖，再从发酵液中提取纯化而成。早在1969年，T.Suzuki等就利用节杆菌以烷烃为碳源发酵生产海藻糖，但产量不高，后人通过采用诱变、细胞融合或基因重组选育提高海藻糖的产量。微生物发酵法虽较天然生物提取法有一定的优越性，但也有其缺点，如转化率低，发酵液副产物多，使得海藻糖的提取、精制困难。③化学合成法。α,α-海藻糖的化学合成主要是在2,3,4,6-四-氧-乙酰基-D-葡萄糖和3,4,6-三-氧-乙酰基-1,2-脱水-D-葡萄糖之间发生环氧乙烷加成反应生成。虽此法早在1954年就化学合成出海藻糖，但至今还难以实用化，主要因为此法产率低，分离困难。④基因工程法。此法生产海藻糖主要分成两种：一是直接把合成海藻糖酶的基因导入作物中去，即构建”转基因植物”，使海藻糖在作物中自行积累；二是通过构建基因工程菌发酵生产海藻糖，提高发酵产量，降低成本。但是海藻糖在植物中的含量较低，因此生产成本仍然很高。⑤酶转化法。许多生物体内有各种不同的海藻糖合成途径，存在相关的海藻糖合成酶系，可以将这些酶系从生物体内提取出来，或者利用基因工程技术高效表达出来，利用这些酶的功能与底物进行催化，可成为大规模生产海藻糖的方法。可加以利用的酶转化法有：磷酸化酶法、麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶双酶法、糖基转移酶和淀粉酶双酶法、海藻糖合成酶法。日本的林原研究所在1995年发现了能够以麦芽糖为底物生成海藻糖的海藻糖合成酶，因其转化反应不需要消耗高能物质，不需要磷酸盐共存，并且该酶的特异性较强，只作用于麦芽糖生成海藻糖，麦芽糖对海藻糖的转化率约为70%-80%。原材料麦芽糖可由淀粉通过酶转化生产，也可直接使用价格便宜的商品麦芽糖浆，原料成本可大为降低，并且麦芽糖转化成海藻糖，仅需一步反应，工艺简单，易于调控。因此海藻糖合成酶转化法也是适宜工业化生产海藻糖的方法。本次论文将海藻糖合成酶法作为主要内容。

海藻糖合成酶是一种变位酶，并具有轻微的水解活性，该酶对麦芽糖和海藻糖的Km受温度的影响很大，过高的反应温度使逆反应（麦芽糖方向）速度增大，从而导致海藻糖产率的下降。因此反应过程要控制好温度。目前对于海藻糖的作用机制尚处于理论推测阶段，日本的林原研究所首先证明了海藻糖合成酶的催化反应是分子内的重排并非分子间的反应.海藻糖合酶氨基酸序列的比对分析发现，海藻糖合酶具有具有α-淀粉酶家族酶类所具有的四个保守区：分别是I XDXXXNH，ⅡGXRXDXXZZ，III XXX(G／A)EZZZ，IV XXBBHD(X为疏水性氨基酸残基，B为亲水性氨基酸残基。Z为影响酶反应特异性的氨基酸残基)。据此推测，海藻糖合酶是α-淀粉酶家族成员之一。所以实现海藻糖的产业化应让海藻糖合酶实现产业化，首先想到了基因工程，把能合成海藻糖合酶的目的基因剪切出来，通过PCR技术扩增，再把目的基因导入宿主细胞内表达。本次研究选择大肠杆菌作为宿主细胞，那么能合成海藻糖合酶的目的基因如何获取成为这次研究的重点。

本实验室获得从新疆辐射污染地表土壤中分离筛选的一株极端耐辐射奇异球菌Deinococcus wulumuqiensis R12。本研究将Deinococcus wulumuqiensis R12基因组进行测序，通过序列比对发现，该基因组上含有海藻糖合成酶基因，将这些关键酶基因克隆以及测序验证后，发现各基因序列与奇异球菌属模式生物Deinococcus Radiodurans R1存在显著差异，约7%左右。我们拟将Deinococcus wulumuqiensis R12中海藻糖合成酶基因进行克隆表达，探讨其序列差异、酶活性质和底物催化活性等。

参考文献：

[1] 韦宇拓，朱绮霞，罗兆飞，陈发忠，李桂媛，黄鲲，黄日波，耐放射异常球菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定，生物化工与生物物理进展，2004，31（11）： 1018-1023

[2] 罗明典，微生物生产海藻糖及其应用前景，微生物学通报，1996，,23（4）：252-254