摘 要

Viburnum dilatatum Thunb.），为忍冬科(Caprifoliaceae)荚蒾属（Viburnum）植物，原产自中国，在我国多个省份均有分布。迄今，荚蒾属植物在我国仅观赏价值得到较大体现，其药用价值则研究较少，亟待开发。本研究共收集荚蒾属植物果实样品两份及叶片样品十二份，应用高效液相色谱法（HPLC）进行荚蒾果实及叶片中维生素C含量的定量测定，通过与维生素C标准曲线进行对比，简单快速地测定荚蒾果实及叶片中的维生素C含量，为荚蒾有效成分和药用价值的深入研究奠定基础。

关键词：荚蒾；维生素C；HPLC；定量测定

Determination of Vitamin C in Fruits and Leaves of
Viburnum dilatatum Thunb by HPLC

Abstract:Viburnum dilatatum thunb is a plant of caprifoliaceae,originating in China,it is widely distributed in most provinces of China.As far as the application of viburnum dilatatum thunb in China is concerned, the value of ornamental value is greatly reflected, but the other utilization value is still to be developed.In this study,2 fruit samples and 12 leaf samples of Caprifoliaceae vlburnum plants were collected,the vitamin C content in fruits and leaves was measured by HPLC technology. By comparing with the standard vitamin C curve, the content of vitamin C in fruits and leaves was measured with accuracy and efficiency, and the scientific basis for further development and utilization of the viburnum dilatatum thunb was provided.

Keywords:Viburnum dilatatum Thunb;Vitamin C;HPLC;Quantitative determination

目 录

第1章 绪论 1

1.1 荚蒾简介 1

1.2 研究目的及意义 2

1.3 HPLC技术简介 2

1.3.1 HPLC技术的概念 2

1.3.2 HPLC技术的发展 3

1.3.3 HPLC技术的优势 4

1.3.4 HPLC技术的发展现状及前景 4

1.4 研究内容及目标 5

1.4.1 研究内容 5

1.4.2 研究目标 6

第2章 荚蒾叶片中维生素C含量测定实验研究 7

2.1 实验耗材 7

2.1.1 试验样品与来源 7

2.1.2 仪器与试剂 7

2.2 实验前准备 7

2.2.1 0.3%的草酸溶液配制 7

2.2.2 维生素C标准品溶液配制 7

2.2.3 高效液相色谱仪实验前准备 7

2.2.4 色谱条件选择 8

2.2.5 维生素C标准曲线绘制 9

2.3 样品叶片中维生素C含量测定 10

2.3.1 果实样品预处理 10

2.3.2 叶片样品预处理 11

2.3.3 样品维生素C含量测定 11

2.4 数据处理与分析 11

2.4.1 试验样品峰面积 12

2.4.2 试验样品维生素C含量计算 12

2.4.3 结果分析 13

2.5 讨论 13

第3章 结论 15

参考文献 16

致 谢 18

第1章 绪论

1.1 荚蒾简介

荚蒾（拉丁学名：Viburnum dilatatum Thunb），是忍冬科荚蒾属植物，主要产地为亚洲东部以及北美洲，全世界现有该物种植物230余种，其中包括灌木和乔木。该属植物可高达3米。叶片呈纸质，形状多为倒卵形，也有宽卵形叶片，长度约为3-10厘米，顶端急尖，叶片基部可呈圆形、钝形或微心形，有时也可为楔形，全缘有锯齿或牙齿，有时有掌状分裂，叶柄长约10-15毫米，无托叶。荚蒾的花序呈复合伞状，具有浓密的聚伞花序。花一般生长在第三至第四级的辐射枝上，白色花冠呈辐射状向外散开，花药为乳白色小花药。果实呈椭圆状卵圆形，一般为红色，核扁，卵形，5-6月开花，9-11月结果。荚蒾为中国原产种，全我国现有品种约80余种，在我国多个省份均有分布，尤以西南地区种类最多。一般来说，它们分布在山坡或山谷的灌木丛中，森林边缘和山脚下。荚蒾是一种温带植物，喜温暖潮湿的环境，但它也能抵抗阴冷，在阴暗寒冷的环境也能生存。荚蒾对气候和土壤条件的要求都不是很高，肥沃的土壤适合其生长，盆栽植物也可以存活和管理^[1]。

荚蒾全株均有作用：果实可直接食用，也可用来酿酒；韧皮纤维可以制造绳和人造棉；种子由于含油量高达10.03-12.91%，因此可用来制造肥皂和润滑油；枝叶有清热解毒、疏风解表的功效，民间多用于治疗疔疮发热、风热感冒，外用还可用于过敏性皮炎的治疗；根辛、涩、凉，对瘰疬、跌打损伤等有祛瘀消肿的作用^[1]。

我国对荚蒾属植物的应用较早，据资料记载，唐代就开始应用琼花。作为中药材，最早在《唐本草》对荚蒾有所记载：荚蒾，叶似木槿及似榆，作小树。其子如溲疏，两两为并，四四相对，而色赤，味甘。檀、榆之类也^[2]。《本草拾遗》对荚蒾的记载为：荚蒾，主六畜疮中蛆，煮汁作粥灌之，蛆立出。皮堪为索。生北土山林间。荚蒾别名酸汤杆、苦柴子，是以其叶、枝、根入药，夏秋时期采集，鲜用或晒干储存后不影响其疗效。

荚蒾属可供观赏的种类较多，如鸡树条荚蒾（Viburnum opulus Linn. var. calvescens）、香荚蒾（Viburnum farreri W. T. Stearn）、陕西荚蒾（Viburnum schensianum Maxim）、金佛山荚蒾（Viburnum chinshanense Graebn）、球核荚蒾（Viburnum propinquum Hemsl）等。荚蒾枝叶茂密浓厚，树冠呈现球形，树叶形状美观，入秋后会变成红色，远远望去，一片红霞如火；5、6月份开花时节，如银似雪的白花，纷纷扬扬布满枝头，阳光照耀下，璀璨生辉；待到果熟时，亮晶晶的红果缀满枝头，灿烂夺目，犹如满树珊瑚，令人赏心悦目。如此集叶花果为一树，实为观赏佳木，是制作盆景的良好素材。纵观该属植物，其观赏价值在我国得到了很好地利用，但是该属植物还有很多其他用途有待开发。比如，荚蒾含有大量维生素C，其食用价值和营养价值都颇高，发展前景十分可观^[3]。

1.2 研究目的及意义

截至目前为止，国内外对荚蒾属植物的种类分布、栽培技术和营养成分报道较多，而对荚蒾中维生素C含量的相关性研究少见报道^[4]。荚蒾属植物除观赏价值与药用价值外，可能还有其他现有研究未发现的价值。本课题就荚蒾叶片中维生素C含量定量测定展开研究，促进荚蒾属植物的开发利用，可能成为开发利用荚蒾属植物的新契机。

维生素是维持人体正常生理功能所必需的微量有机化合物的通称。 目前，共有13种维生素被公认为“十三太平洋保护剂”^[4]。 在维生素家族中，维生素C比较特殊，具有多种特异性和一系列生理功能，对人体健康和食物营养价值有重大影响。 维生素C因为其抗坏血酸效果，有机酸性质和明显的酸味也被称为抗坏血酸，它有很强的抗氧化作用，是维持人体正常生理代谢的一种重要化合物，人体若严重缺乏维生素C会引起坏血病^[6]。维生素C还具有预防和治疗缺铁性贫血、预防白内障和心血管疾病的作用^[7]。近年来，医学研究发现，充足的维生素C能提高人体的免疫力，预防感冒，防止某些皮肤疾病的发生，特别是其抗癌作用与在肝炎、肝硬化等方面具有的良好疗效。但人体自身不能合成维生素C，必须从食物中获取，维生素C广泛存在于新鲜的水果蔬菜中^[8]。

传统维生素C含量测定有荧光法、2，6-二氯靛酚法和直接碘量法等，这些传统方法一般都是用肉眼观测滴定终点，且用于判断滴定终点的有色化合物性质不稳定，因此测定结果误差大、特异性低^[9]。相比之下，高效液相色谱(HPLC)方法在特异性、敏感性或易操作方面具有很大的优势^[10]。本课题采用HPLC技术对荚蒾叶片中维生素C含量进行定量测定，可以降低测量误差，使测量结果更加准确，增加测量结果可信度，为荚蒾属植物进一步的开发利用提供科学依据。

1.3 HPLC技术简介

1.3.1 HPLC技术的概念

液相色谱分析是指流动相为液体的色谱技术,是色谱法中最古老的一种^[11],通过改进填料的粒度及柱压,在经典的液相柱色谱的基础上引入了气相色谱的塔板理论，在技术上采用了高压输液泵,高效固定相和高灵敏度的检测器,实现了分析速度快.分离效率高和操作自动化，这种色谱技术被称为高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography ,HPLC），又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。HPLC是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。HPLC技术的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，应用十分广泛。

HPLC仪包括“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”等部分^[12]。高压输液泵通过流动相和样品施加压力，驱动其通过色谱分离柱和检测系统；色谱柱则用于分离各部分物质。进样器负责将待分析样品引入色谱系统，再由检测器将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号，此时，数据获取与处理系统会把检测器检测到的信号显示出来。如果需要做其他波谱坚定或是为了获取少量试验样品的小型制备，还需要进行馏分收集。对于纯粹的色谱分析而言，馏分收集是不必要的。HPLC实验装置如图1.1所示。

图1.1 HPLC装置示意图

1.3.2 HPLC技术的发展

HPLC技术最在萌芽于1941年，马丁和辛格预言了小直径粒子和高压差在液相色谱中的必要性。之后，在马丁和辛格开创性工作的基础上，吉丁斯、哈勃等人进一步做出改进使HPLC模式能够适用于液相色谱^[13]。

1958年，斯坦因和莫尔发明了HPLC仪的第一个雏形——氨基酸分析仪（AAA），这一仪器的出现最终对HPLC方法的建立直接产生了推动作用。六十年代早期，莫尔发明了凝胶反相色谱技术（GPC），随后，华特斯有限公司就推出了GPC仪，这个仪器在氨基酸分析仪的基础上进行了改进，可以进行HPLC分离。1968-1971年期间，里普斯克、哈伯、莆黑斯、科克兰和荷瓦斯等人研制发明第一台普适的HPLC商业系统。

HPLC仪器的发明创造促进了HPLC研究小组的成立，这使得各个小组之间能够迅速交换研究成果与讯息，加速了HPLC的研究进程，随之而来的是，第一批有关HPLC的论文的发表。在此基础上，第五届国际色谱进展讨论会在拉斯维加斯召开，这也是HPLC研究者们第一次参会。会议讨论内容大多出版记载于《气相色谱杂志》。

1971年，发生了HPLC发展史上的第一个里程碑事件——由科克兰编辑的《现代液相色谱实践》一书最终出版，并且，杜邦公司仪器产品局和特拉华色谱论坛牵头主办了一场由科克兰和斯尼德等人主讲的HPLC课程，这一课程为期三天，详细而准确地介绍了当时还处于萌芽期的HPLC技术。这一举动极大的推动HPLC的发展。

此后，HPLC逐渐被越来越多的研究者们所了解，越来越多的研究者参与到HPLC的研究之中，并不断对HPLC技术进行了改进和完善。1971年以后，生物大分子（如蛋白质等）以及对映异构体的HPLC分离被逐步建立起来，并于1975年开创了HPLC的生化分离，1979年实现手性旋光分离，1980年计算机技术被应用于HPLC技术。到20世纪80年代中期，HPLC分析技术已经成为一项成熟的技术。可谓发展非常迅猛。直至今日，HPLC技术一直在完善发展之中。

1.3.3 HPLC技术的优势

因为中药含有复杂的成分，在检测结果的准确度、灵敏度以及精确度等当面，薄层色谱等分离分析方法传统方法均不能达到现代中药分析的要求。因此急需一种可靠、稳定、高效的分析方法来代替传统分析方式，而HPLC技术无疑是最好的选择。

HPLC技术有“四高一广”的特点^[14]：

①高压：在流经色谱柱时，作为流动相的液体将会受到较大的阻力。如果对载液加高压，就可以使流动相迅速通过色谱柱。

②高速：与经典液体色谱法相比，HPLC在载液流速和分析速度方面都具有较大的优势，一个样品的分析时间通常需要约15～30分钟，某些样品的分析时间甚至能够缩短至5分钟以内，样品分析时间一般不会超过1小时。

③高效：分离效能高。流动相和固定相均可根据分离的样品进行选择，故可以更轻松地达到最佳分离效果，分离效能与工业精馏塔和气相色谱相比，要高出许多倍。

④高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达0.01 ng，进样量在μL数量级，远高于其他分离分析技术。

⑤应用范围广：HPLC分析可以用于百分之七十以上的有机化合物的分离分析，特别是在热稳定性差、强极性、大分子、高沸点等化合物的分离分析中的应用，尤其能显示出HPLC的优势。此外，相较于气相色谱需在较高温度下进行的要求，HPLC在室温条件下就可以进行分析。

⑥柱子可反复使用：HPLC分离柱在使用后可用流动相进行冲洗，因此用一根柱子就可以达到不同化合物分离的要求。

⑦样品量少、容易回收：由于样品经过色谱柱并不会被破坏，故可以实现单一组分的收集或制备。

1.3.4 HPLC技术的发展现状与前景

HPLC技术因其“四高一广”的特点，已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用，并且在各种中药有效成分的测定中已经得到了广泛应用，如香豆素、生物碱、蒽醌、黄酮、皂苷等^[15]。近年来，许多学者对HPLC在监测中药中的应用进行了研究,由于HPLC结合了经典液相色谱和气相色谱两者的优势,因此无论是从分析程度、选择性还是柱效等方面来看，HPLC都处于或高于它们的水平。近年来研究者们在不断探索寻找改进HPLC技术的不足之处的方法,希望使这项技术更加完善。现阶段，研究者们致力于缩短HPLC技术分析时间，进一步提高HPLC技术分离效率，使其向联用技术、智能化、自动化等方面发展。

中药全成分分析应景成为了现代中药分析的主流趋势，通过对从单味药到复方的不同配伍，甚至煎煮时间等进行系统研究，才能找到中药中化学成分的变化规律，并最终达到发现中药机理之间内在联系的目的。但是，由于中药中含有非常多的成分，且各成分之间化学性质不尽相同，跨越各个酸碱度与极性范围，这对成分分析方法在灵敏度等方面提出了更高的要求^[16]。大量研究结果表明，HPLC技术在分析中药成分，尤其是高极性化学成分方面具有很大的优势。如果能够与一些先进的检测仪器联用的话，将会使高效液相应用更为广泛，并且能够使HPLC技术灵敏度高、选择性好、高效快速等优点得到更好的发挥。如果能够联合质谱或者与柱切换技术以及梯度洗脱结合使用，与先进的检测技术相配合，再结合其他学科，如现代分子药理学、分子生物学等，必将会在中药分析方面发挥巨大作用。

1.4 研究内容及目标

1.4.1 研究内容

HPLC包括吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法和分子排阻色谱法^[17]。反相高效色谱法（RP-HPLC）是指流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，RP-HPLC通常使用的是非极性键合固定相，它是将全多孔(或薄壳)微粒硅胶载体,经酸活化处理后与含轻基链(C4、C8、C18)或苯基的硅烷化试剂反应,生成表面具有烷基或苯基的非极性固定相，通常选用十八烷基键合硅胶。以甲醇和乙腈为流动相。当今液相色谱的最主要的分离模式就是RP-HPLC，几乎所有能溶于弱极性或极性溶剂中的有机物的分离都可以通过RP-HPLC来完成。RP-HPLC疏水的分离机制使得RP-HPLC适于分离非极性、极性或离子型化合物，因此用RP-HPLC就可以完成大部分的分析任务，应用范围较正相色谱法（NP-HPLC）更广泛。

本课题采用RP-HPLC对维生素C标准品、2个荚蒾果实试验样品以及12个荚蒾叶片试验样品进行维生素C含量测定，通过HPLC仪的数据处理系统得到维生素C标准曲线以及荚蒾叶片中维生素C含量曲线。通过维生素C 标准曲线进行对照与计算，最终得到样品荚蒾果实及叶片中维生素C含量。

1.4.2研究目标

通过科学的定量测量技术得到荚蒾属植物果实及叶片中维生素C含量数据，再与其他常见维生素C来源进行比较，讨论荚蒾属植物是否可用于获取维生素C或作为天然维生素C提取的原材料，为荚蒾属植物中维生素C的开发利用提供基础。并通过研究探证荚蒾属植物除作为观赏植物外，是否还可作为食用或药用植物进行栽种培植，为荚蒾属植物的应用开拓更宽广的市场。

第2章 荚蒾果实及叶片中维生素C含量测定实验研究

2.1 实验耗材与方法

2.1.1 试验样品与来源

本研究通过野外采集、市场购买等方式获取样品，经过湖北中医药大学胡志刚副教授鉴定，样品保存在武汉理工大学化学化工与生命科学学院中药资源与分子鉴定实验室。详见表2.1。

2.1.2 仪器与试剂

本次实验所用仪器及试剂如表2.2、表2.3所示。