摘 要 氧化苦参碱（Oxymatrine,OMT）是一种奎诺里西啶类药物，可由豆科槐属植物苦豆子与苦参根中提取分离得到。其具有抗炎、抗心律失常、抗肿瘤、提高免疫能力等众多作用。然而氧化苦参碱的强亲水性使其胃肠道的渗透性及吸收度较差,不利于口服给药，且临床应用的氧化苦参碱注射液半衰明短、疗效低。以延长OMT作用时间、增加体内稳定性为目的，本课题在普通纳米粒制备工艺研究基础上，重点研究了MPEG-PCL载体纳米粒的制备方法，完成了纳米粒工艺的优化与相关表征等研究工作。 本文采用pH梯度法通过主动载药包裹氧化苦参碱以制备纳米粒，并对制备纳米粒作了质量评价。依据正交实验筛选出制备氧化苦参碱纳米粒的最佳处方为: 孵育温度为60℃，外水相pH值为4.0，药载比1:10。通过观察形态、测定粒径及粒度分布、测定包封率与载药量、体外释放等进行纳米粒的表征。本实验课题表明氧化苦参碱纳米粒具有缓释长效作用与选择性富集于病灶部位的优点。 关键词：氧化苦参碱；纳米粒；pH梯度法

Abstract

Oxymatrine (OMT) is a quinolithiid drug that can be extracted and extracted from the root of Sophora alopecuroides and Sophora flavescens. It has many functions such as anti-inflammatory, anti-arrhythmia, anti-tumor, and immunity enhancement. However, the strong hydrophilicity of oxymatrine makes its gastrointestinal tract permeability and absorption poor, which is not conducive to oral administration, and the clinical application of oxymatrine injection has short half-life and low efficacy. For the purpose of prolonging the action time of OMT and increasing the stability in vivo, this topic focuses on the preparation method of MPEG-PCL carrier nanoparticles based on the research of ordinary nanoparticle preparation process, and completes the optimization and related characterization of nanoparticles process. jobs. In this paper, pH gradient method was used to prepare nanoparticles by active loading of oxymatrine, and the quality of prepared nanoparticles was evaluated. According to the orthogonal experiment, the best prescription for preparation of oxymatrine nanoparticles was: the incubation temperature was 60°C, the external aqueous phase pH was 4.0, and the drug loading ratio was 1:10. The characterization of nanoparticles was performed by observing morphology, measuring particle size and particle size distribution, determining encapsulation efficiency and drug loading, in vitro release, and the like. The experimental task shows that the oxymatrine nanoparticles have the advantages of slow-release long-acting effect and selective enrichment at the lesion site. Key words: Oxymatrine; Nanoparticles; pH gradient 目 录 摘要 I Abstract II 第一章 绪论 1 1.1前言 1 1.1.1氧化苦参碱的性质与功能 1 1.1.2氧化苦参碱的应用现状及存在的问题 1 1.1.3氧化苦参碱的研究现状 3 1.2纳米载药系统 3 1.2.1纳米载药系统的概述 3 1.2.2靶向纳米载体系统 4 1.2.3纳米载药系统的制备方法 4 1.3研究课题的提出 4 1.3.1研究背景、目的及意义 4 1.3.2主要研究内容 5 1.3.3课题创新点 5 第二章 氧化苦参碱纳米粒的制备 6 2.1实验仪器与材料 6 2.1.1主要实验仪器 6 2.1.2主要实验材料 6 2.2氧化苦参碱纳米粒的制备方法 7 2.3单因素考察氧化苦参碱纳米粒的处方与工艺 8 2.3.1外水相的PH值 8 2.3.2孵育的温度 9 2.3.3载药比 9 2.3正交设计法优选最佳处方 9 2.4最佳工艺验证 11 第三章 氧化苦参碱纳米粒的表征 12 3.1氧化苦参碱标准曲线的绘制 12 3.2氧化苦参碱纳米粒质量评价 13 3.2.1透射电镜观察纳米粒形态 13 3.2.2纳米粒径测定 13 3.2.3载药纳米粒稳定性研究 14 3.3载药量的测定 14 3.4载药纳米粒的体外释放研究 14 第四章 结论与展望 17 参考文献 18 致谢 19

第一章 绪论

1.1前言

1.1.1氧化苦参碱的性质与功能

氧化苦参碱属于一种喹诺里西啶类生物碱，可以从我们所熟知的传统中豆科槐属植物苦豆子及苦参根中提取分离得到。氧化苦参碱分子式为C₁₅H₂₄N₂O₂，其化学结构如下图。氧化苦参碱溶于水、甲醇、乙醇、氯仿、苯，难溶于乙醚^[1]。 图1 氧化苦参碱化学结构 现代科学对氧化苦参碱的多年钻研，已确认氧化苦参碱具备多种药理特征，此中最常见的有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等，特别是在医治病毒性肝炎方面获得杰出疗效，临床成果表现对慢性乙型肝炎、丙型肝炎、肝纤维化等具备较好的医治作用。最近几年报道还表明氧化苦参碱能抑制肿瘤细胞增殖、转移，诱导其凋亡、及向正常细胞分化，可以在治疗肿瘤的领域里发挥巨大作用。

1.2.2氧化苦参碱的应用现状及存在的问题

当今临床利用较多的氧化苦参碱注射液，存在消除半衰期较短，人体内约为 1.5h^[2]，属快速消除类，体内消除快，分布范围较小，血药浓度较低，肝脏组织浓度较低，同时肌肉注射局部疼痛较明显，病人很难长期用药等缺点，限制了药物的临床运用与发展。

1.1.3氧化苦参碱的研究现状

近年来报道表明，OMT有很明显的抗炎效果。OMT能显著抑制肺脏中NF-B的活化，从而降低炎性因子及其粘附分子的表达，减少炎症。细胞聚集。李燕子等采用使用二甲苯使小鼠的耳部发生肿胀，以建立炎症模型，予以OMT干预，结果显示OMT组抗炎作用显著，作用的大小与其剂量密切相关。OMT对多种病毒都有明显药效，被发现有广泛的抗病毒作用。可诱生人白细胞产生的－干扰素，从而达到抗病毒感染的作用。陈小璇等发现OMT可通过抑制流感病毒诱导的TLR4-Myd88-TRAF6-NF-KB信号通路活化而抑制流感病毒。孙永梅等证实OMT有抗柯萨奇B3病毒（CVB3）的作用力，对大鼠感染CVB3后的心肌细胞能起到很好的保护作用。OMT具有广泛的抗细菌作用，包含多种常见杆菌与耐药菌等。李媛媛等对OMT的抑菌活性进行检测，结果显示OMT可以抑制大肠埃希菌的生长，其抑菌作用可随OMT用药时间的增长与用药剂量的增加而增强。苦参类生物碱在多方面显示较好的抑制肿瘤的活性，包括诱导肿瘤细胞分化与凋亡，控制肿瘤细胞的增殖转移、阻碍肿瘤新血管的形成、抑制端粒酶的活性、控制肿瘤耐药性以及促进人体抗肿瘤免疫反应等^[3]，对许多类型的肿瘤都有治疗效果。此外还具备提高免疫力、增加白细胞、改善恶病质形态和减轻放化疗副作用的效果。心律失常是一种很难治疗的病症，在心血管治疗领域内是一大难题。最近报道表明OMT在治疗心律中起到非常好的效果。Runtao应用全细胞膜片钳技术发现OMT可以极大延缓大鼠结扎冠状动脉后出现心律失常症状的时间，还能减少持续的长短，降低其死亡率。 Dawei Wang等研究了氧化苦参碱治疗可通过调节TGF-β1/ Smad3信号通路来防止CPR的作用。Yibai Xiong等研究了一种慢性氧化苦参碱疗法通过靶向结肠直肠癌细胞中的长非编码RNA MALAT1，诱导抵抗和上皮 - 间充质转变。Liqiang Qian等研究了氧化苦参碱可以在GBC细胞内抑制PTEN / PI3K / AKT功能通路调控肿瘤发生。Jiang Liang等研究了氧化苦参碱可能通过抑制滑膜细胞的活化，迁移，侵袭和增殖来保护RA的关节破坏。Xian Zhang等研究了氧化苦参碱抑制TLR4 / PI3K / Akt / GSK-3β信号通路抑制肝细胞凋亡，进而有效改善急性肾衰竭。Xiuxiu Sang等研究氧化苦参碱对增强免疫力功能和控制HBV抗原的有益效果。 世界各国，为了解决氧化苦参碱在临床上体内生物利用度低、所需剂量大等问题，已经研究发表了各种各样的的剂型专利。其中氧化苦参碱纳米制剂是现阶段学者研究得比较多的剂型，主要包栝载体纳米粒、固体脂质体纳米粒、脂质体等等。通过固体脂质纳米粒化后的氧化苦参碱，可以在很大程度上增强它的药理治疗效果。根据最近研究表明，通过将氧化苦参碱制备成脂质体，讨论氧化苦参碱脂质体是否具备提高药物靶向与增加生物利用度的效果。其研究结果表明，将氧化苦参碱制成脂质体，对、肝、肺等富有网状内皮细胞的器官中的药物浓度较传统剂型都特别明显的提高。 与普通的药物剂型进行比较我们可以知道，具有被动靶向性是纳米药物制剂最突出的特点之一。文献报道显示，把氧化苦参碱制成载体纳米粒，可以增加氧化苦参碱在体内的作用时间与生物利用度。显然，将氧化苦参碱制备成纳米粒拥有广阔的发展前景和研究空间。

1.2纳米载药系统

1.2.1 纳米载药系统的概述

纳米载药系统是基于药物被分散、包封、吸附于聚合物粒子上形成的纳米粒大小界定在1～1000nm之间的药物传递系统。一般地，纳米载药系统可以将药物运送到肿瘤部位，可以使药物在肿瘤部位聚集发挥更好的疗效。由于载药纳米系统具有特殊的靶向性，对机体的正常部位毒副作用较弱甚至无毒副作用。另一方面，良好的纳米载药系统能增加疏水性药物在水中的溶解特性、药物的载药量，能够保护药物在传递中不被降解，减少肾脏和内皮网状系统的清除率。 根据纳米不同载体与药物的结合方式，通常把纳米载药系统分为两个类别：第一个种类是药物与载体以共价键的方式直接结合，做成为纳米载药系统，最通常的是聚合物-药物型与聚合物-蛋白质型；第二种是药物与载体通过非共价键进行结合，一般以物理包埋的方式制成，主要包括聚合物纳米粒、纳米胶束、脂质体^[4]。

1.2.2靶向纳米载体系统

纳米给药系统通常指纳米级别的药物运输系统，由所需药物与适当的药用材料组成。纳米系统能够对生物利用度的提高有明显的有益作用，进而大幅度降低给药剂，有非常广阔的医学应用价值与前景。由于纳米粒的粒径不同，主要集中的部位亦有所区别。根据报道表明^[4]，肝脏易获取小于500nm且大于100nm粒径范围内的微球,小于100nm、大于50nm肝实质细胞则允许粒径在50nm至100nm的微球透过进入,而肝脏内皮则允许粒径小于50nm的微球透过。粒径小于50nm的微球也经过淋巴系统到达骨髓与脾脏细胞,亦或者能透过血脑屏障达到脑组织的位置。由此我们不难发现纳米粒对肝脏部位具备较强的被动靶向,能够令药物聚集于肝脏部位,进而降低对其他正常组织的毒副作用，可以有效提高在肝脏部位的药物浓度，进而提高药物疗效，同时降低药物剂量，相对于普通注射剂可以减轻患者痛感,是实现肝脏靶向的有效手段。并且纳米粒可以起到缓释作用，令药物在体内更长效减少药物服用频次。同时，纳米粒还有保护药物、减轻毒副作用的优点,能够在对肝脏疾病的治疗中发挥重大作用。 依据药物的靶向方式的不同，纳米系统可以分为主动靶向与被动靶向两种类型。纳米粒主要是凭借“高渗透性和滞留效应”聚积在肿瘤组织部位，即称之为被动靶向。由于实体瘤组织细管壁的间隙相对较宽，结果相对不完整，又因为不正常的淋巴回流，致使粒径较小的纳米例子可以定向集中在肿瘤部位。其能被动靶向的原因在于实体瘤组织的血管壁间隙比较宽、结构完整性比较差，而淋巴回流不正常，从而导致尺寸较小的纳米粒子可以聚集在肿瘤组织，并将药物释放。Park曾采用PLGA脂质体纳米粒包载阿霉素用于治疗心肌病，其实验结果显示取得了很好的治疗效果。另一类靶向则是主动靶向，通过把经过修饰改造的纳米载体表面，引入特异性的配体，其配体可以令癌细胞表面的特异性受体或过表达抗原识别，故而能大幅度增加抗癌药物的治疗效果，同时可以减少或者避免很多毒副作用。研究表明，在增加了纳米粒主动靶向性的同时，将纳米粒表明进行修饰还可以有效提高药物疗效，同时针对药物耐受性的不足也有较好的克服。

1.2.3纳米载药系统的制备方法

根据纳米粒作用目标，在制备纳米粒主要的考虑因素因该是粒径的大小并且得到分布较均匀同时较窄的纳米粒。保证药物的治疗效果、用药的安全感和药品的稳定性是药品行业最基本的要求。故而在设计纳米粒的制备方法时，要综合实际情况制备纳米粒，包括考察经费、条件、产量等。 在选用不同方法制备纳米粒时，主要依据药物和载体材料的理化性质，所需纳米粒的大小，释放特效的要求等。而根据不同的形成方式，纳米粒又分为聚合反应制备法和聚合材料分散制备法的种制备方法类型，对于这两种方法，我们可以简称为聚合法与分散法。根据报道表明，聚合法是因载体材料单体发生聚合反应为名，载体发生聚合过程的同时把药物进行包裹，制备出纳米粒。根据反应条件不同，可以细分为乳液聚合法、交联聚合法与界面聚合法等。因为聚合反应不可能完全发生反应，其反应过程也通常会有没有反应完的单体或其他聚合反应物，而且聚合反应中运用的引发剂、表面活性剂等也会残留在纳米粒中，这些物质对人体而言会产生一些不良作用，这就限制了聚合法广泛的使用。由于今年的研究表明采用聚合反应法制备纳米粒有明显弊端，而这些弊端可以有效被分散法所规避，所以近年来一般采用分散发制备纳米粒。其中的典型代表有凝聚分散发、自聚集法、高压乳匀法，在制备不同的纳米粒时，在不同条件下再选择相对应的制备方法，可以制备出相对较好的纳米粒。

1.3研究课题的提出

1.3.1研究背景、目的及意义

根据最近几年的研究报道表明，我们不难发现氧化苦参碱有诸多的药理活性，比如氧化苦参碱被发现具有抗炎、抗病毒、抗心律失常、抗纤维化诸多广泛的药理作用。氧化苦参碱也有抗肿瘤的特性，对胃、肠、肝等组织器官的肿瘤细胞都有增殖抑制的作用效果。氧化苦参碱注射液是市面上流通较为主要的剂型，却在生物利用度上存在明显缺点。因氧化苦参碱在体内消除半衰期只有1.5小时左右，致使药物无法有效分布，并且血药浓度非常不理想，对于所治疗的肝脏部位浓度并没有预期的效果。对此，常规注射剂难免要增加注射频率弥补生物利用度低的缺点，但是显然效果并不理想，因为氧化苦参碱注射剂的痛感明显，病人在高频率的肌肉注射难以长久坚持下来。因为种种不足，极大地限制了氧化苦参碱的药效发挥与临床应用的发展。为了使氧化苦参碱在临床上能够得到更广泛的推广，研究学者们将目光转向了纳米载体。纳米载体能够增加药物的水中溶解特溶性和稳定性，因为纳米粒最本质的特点即纳米级的粒径，可以使得其在延长药物在体内循环时间和提高药物靶向部位浓度方面拥有非常大的优势。 最近几年对于氧化苦参碱的研究重心与方向主要放在了纳米载体给药系统。根据文献记载，为了达到定向定量控制药物释放的目标，一些环境敏感性纳米概要系统可以针对不同环境比如温度进行相应的调节，使药物按照设计进行释放。在治疗癌症的研究领域中，环境敏感性纳米给药系统因癌组织细胞的与其他组织不同的环境条件，可以将抗癌药靶向释放进行有效治疗 本论文就氧化苦参碱纳米粒的制备及评价进行研究，采用单甲氧基聚乙二醇聚己内酯共聚物MPEG-PCL作为纳米载体，通过PH梯度法主动包载氧化苦参碱制备成纳米粒。进而希望本实验课题能够对氧化苦参碱的研究起到一定参考作用。

1.3.2主要研究内容

本课题的研究内容为氧化苦参碱纳米粒的制备与表征，故将主要内容分为以下三部分。 ⑴氧化苦参碱纳米粒的制备； ⑵氧化苦参碱纳米粒工艺条件的筛选； ⑶氧化苦参碱纳米粒的表征，包括纳米粒的形态、粒径、包封率、载药量、释放。

1.3.3课题创新点

本实验课题通过运用纳米粒包载氧化苦参碱，是提高氧化苦参碱生物利用度的一种比较好的方法，该研究方法具有一定的创新性。而本实验选用单甲氧基聚乙二醇聚己内酯共聚物纳米载体，借助该载体具有安全无毒、价格低廉等优点，是绿色安全的纳米材料，这又是本研究的一个亮点。 本实验课题制备氧化苦参碱纳米粒，采用PH梯度法令载体主动包载氧化苦参碱制备成纳米粒，使氧化苦参碱发挥药效。本研究过程对氧化苦参碱靶纳米粒的制备工艺进行了考察，筛选出最佳氧化苦参碱纳米粒最佳工艺，并对制得的纳米粒进行了粒径、包封率与载药量、释放等相关表征与评价。  

第二章 氧化苦参碱纳米粒的制备

2.1实验仪器与材料

2.1.1主要实验仪器

实验所用主要仪器如表2.1所示：