论文总字数：19709字

摘 要

脂肪酶具有高选择性，高稳定性，反应条件温和，不需要辅酶等优良特性，能高效催化水解，酯化，转酯化，醇解，氨解等系列反应，广泛应用于医药，化工，食品，饲料和能源等行业。

我们以猪胰脂肪酶为研究对象，用羰二咪唑法将功能性离子液体的活性官能团活化，然后与分离纯化的PPL特定氨基酸残基在低温条件下进行共价连接，实现酶分子的化学修饰，以三硝基苯磺酸法测定修饰酶的平均修饰度，研究修饰剂的结构和修饰度与酶学性质变化的关系，考察修饰前后脂肪酶的水解活力，最适温度，最适PH，耐有机溶剂性等酶学性质。对修饰前后的酶进行紫外，荧光等光谱学表征，考察脂肪酶的空间结构和微环境变化。

结论：PPL经1-羟乙基-3-甲基咪唑氯盐和1-羟乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐修饰后，最终确定修饰剂与PPL的最优摩尔比为120:1。原酶和修饰酶的最适温度都为45℃，其中部分PPL经修饰后温度适应范围变广，如PPL-H₂PO₄的最适温度为40℃到45℃。与原酶相比，修饰酶的稳定性有所提高。修饰酶的最适PH比原酶略高。原酶的最适PH是7，修饰酶的最适PH是7.5。甲醇的有机溶剂耐受性比原酶有所提高，但修饰酶对二甲基亚砜的耐受性反而比原酶降低很多。PPL-Cl的平均氨基修饰度为10％，PPL-H₂PO₄的平均氨基修饰度为15％。紫外吸收光谱和荧光光谱说明PPL确实发生了化学修饰，且导致酶分子结构发生一定的改变。

关键词：化学修饰，PPL，稳定性

Abstract

Lipase has many excellent characteristics, including high selectivity, high stability, mild reaction conditions and so on. It can efficiently catalyze the hydrolysis, esterification, transesterification, alcoholysis, aminolysis reaction and widely be used in pharmaceutical, chemical, food, feed and energy industries.

In this study, porcine pancreatic lipase (PPL) was mentioned by a series of ILs composed of hydroxyl groups. ILs activated by carbonyldiimidazole were grafted onto the purified PPL through lysine coupling, and the amino groups of lysine residues were modified at low temperature. The average degree of modification was determined by trinitrobenzene sulfonic acid method. We discussed the relationship between structure changes and enzymatic properties, the hydrolytic activity, optimum temperature, optimum PH, resistence to organic solvents of modified lipase. Conformational changes confirmed by fluorescence and UV spectroscopy aims to elucidate the mechanism of catalytic performance.

Conclusion: PPL were modified by 1 - hydroxyethyl 3 - methylimidazolium chloride and 1 - hydroxyethyl 3 - methylimidazolium tetrafluoro borate. After modification, the optimum temperature remained at 45 ℃ without changes, and the modified PPL were more resistant to temperature and pH changes. The optimal pH of modified PPL was slightly higher than the native enzyme. Another phenomenon worth considering was the same order of the relative activities in different organic solvents. The tolerance of modified enzyme to methanol was higher than the native enzyme, but the dimethyl sulfoxide had the opposite effect. The average degree of PPL-Cl was 10%, while PPL-H₂PO₄ was 15%. Compared with the native PPL, the UV and fluorescence adsorption of modified PPL exhibited changes after chemical modification. Consequently, it proved that the chemical modification really caused changes in the molecular structure.

Keywords: chemical modification, PPL, stability

目录

目录

摘要 1

Abstract II

目录 III

第一章 文章综述 1

1.1脂肪酶的特性 1

1.2化学修饰： 3

1.2.1化学修饰的类型 3

1.2.2化学修饰脂肪酶的研究现状 3

1.3离子液体 6

1.3.1离子液体的分类 6

1.3.2离子液体的特性 7

1.3.4离子液体的前景 7

第二章实验材料和仪器 10

2.1：实验材料 10

2.2 实验仪器 10

第三章实验方法和结论 11

3.1：功能性离子液体的合成： 11

3.1.1：1-羟丁基-3-甲基咪唑氯盐的合成 11

3.1.2：阴离子交换 11

3.2：酶的预处理 12

3.3酶的纯化： 12

3.4功能性离子液体化学修饰PPL 14

3.5酶学性质的考察 17

3.5.1 蛋白质浓度的测定 17

3.5.2修饰度的测定：TNBS法 17

3.5.3 PPL活力的测定 18

3.5.4最适温度的测定 19

3.5.5最适PH的测定 20

3.5.6耐有机溶剂的测定： 20

3.5.7光谱表征 21

第四章结论与展望 24

参考文献 24

致谢 27

第一章 文章综述

猪胰脂肪酶( porcine pancreas Lipase, PPL) 属于胞内酶, 是近 10 年来国内外研制成的诊断试剂工具酶之一，在临床医学上常用作血清 TG 测定试剂盒。PPL 是一种高活性的生物制剂，其作用位点是脂肪分子的 1( 或 3) 位的酯键，它的多肽链一般会折叠成两个结构域， 在 N-末端的活性部位有一条可结合长链脂肪酸的疏水性通道，该通道从催化部位的 Ser 直到分子的表面。PPL 催化水解时许多因素对酶的活性有影响，这些因素会导致酶催化能力的升高或降低，产生抑制或激活作用^[18]。

1.1脂肪酶的特性

脂肪酶( 又名三酰甘油酯水解酶) 是一类能在油水界面或水不溶性系统中催化水解、酸解、醇解、胺解、酯化、转酯和酯交换等多种化学反应的生物催化剂，具有化学选择性“立体选择性”位点选择性和底物专一性等特点。目前，我们对脂肪酶的结构和性能已有了大量的研究，表明不同来源的脂肪酶虽然氨基酸组成不同，但是其催化中心具有相同或相似的区域，大多数的脂肪酶的活性中心由丝氨酸( Ser) 和组氨酸( His)参与组成，Ser和His 与另一种氨基酸残基一起构成脂肪酶催化活性中心的三元组^[35]。

催化特性:脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。其催化特性在于 ：在油水界面上其催化活力最大，溶于水的酶作用于不溶于水的底物，对均匀分散的或水溶性底物不作用，反应在 2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。Macrae等研究表明：在油水界面上油脂量决定脂肪酶活性，增加乳化剂量，可提高油水界面饱和度，从而提高脂肪酶活性，增加油水界面面积，可承载更多脂肪酶分子，也可增加催化反应速率。而在水体系中，大多数脂肪酶活性很低或没有活性。由于脂肪酶在非均相体系中表现出的高催化活性，且在酶催化反应中不需要辅酶，所以可利用非水相中的脂肪酶催化完成各种有机合成及油脂改性反应，如 ：酯化、酸解、醇解、转酯、羟基化、甲基化、环氧化、氨解、酰基化、开环反应和聚合等反应。

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