论文总字数：18712字

摘 要

环磷酸腺苷（cyclic adenosine-3’,5’-monopHospHate，简称cAMP），是一种具有细胞内信息传递作用的小分子，被称为第二信使，在生物体内广泛存在 ，对糖代谢、脂肪代谢、核酸合成、蛋白质合成以及细胞分化、癌变、逆转等多生理生化过程发挥着重要的调控作用。

　 cAMP作为细胞内的第二信使，其生物合成受到严格的代谢调控。为使其过量积累，只有运用代谢工程的手段，去除代谢通路中不必要的分支途径，促使碳流流向目的产物积累的方向；或者切除产物的分解途径，避免发酵过程中产物的降解。

本文通过一种快速、有效的构建大片段同源重组质粒的方法进行基因敲除，与传统同源重组质粒相比，具有更高的筛选效率；分别敲除了Arthrobacter CGMCC 3584菌株的肌苷酸脱氢酶和cAMP特异性磷酸二酯酶，阻断了cAMP合成途径中的代谢支路和分解途径，提高了菌株的cAMP合成能力，从分子改造方面为构建cAMP高产菌株奠定了基础。

关键词：环磷酸腺苷 基因敲除 代谢控制育种

Abstract

cAMP, an intracellular information transmission having the role of small molecules, referred to as second messengers, widespread in vivo, on glucose metabolism, lipid metabolism, nucleic acid synthesis, protein synthesis, cell differentiation, carcinogenesis, reverse and other pHysiological and biochemical processes plays an important role.

Intracellular cAMP as a second messenger, which is subject to strict biosynthetic metabolic regulation. To make excessive accumulation, only the use of metabolic engineering tools to remove unnecessary metabolic pathways branching pathways to promote the flow of carbon flow direction of the desired product accumulation; or decomposition pathways removal products, to avoid degradation product of the fermentation process.

Paper fast and effective construction of the large fragment of the plasmid by homologous recombination of a knockout method, compared with the conventional homologous recombination vector with higher efficiency of screening; each knockout strain Arthrobacter CGMCC 3584 inosinic acid removal catalase and cAMP-specific pHospHodiesterase, blocked the cAMP synthesis pathway metabolic branch and decomposition pathways, improved strains of cAMP synthesis, high-yield strains of cAMP to build the foundation from the transformation of the molecule.

Keywords: cyclic adenosine monopHospHate knockout arthrobacter metabolic control breeding

摘要 I

Abstract II

第一章 前言 1

1.1 cAMP研究背景 1

1.1.1 cAMP简介 1

1.1.2 cAMP的作用 1

1.1.3 cAMP在畜牧业中的应用 2

1.1.4cAMP在家禽生产中的作用 3

1.1.5 cAMP的巨大价值 3

1.2 cAMP的制备方法 4

1.2.1 化学合成法 4

1.2.2 酶法 5

1.2.3 发酵法 5

1.3 本课题立题依据 6

第二章 材料与方法 7

2.1材料 7

2.1.1菌株和质粒 7

2.1.2 试剂、培养基、琼脂糖凝胶 7

2.1.3 实验仪器 8

2.2 方法 9

2.2.1 本课题中使用到的基本操作 9

2.2.2敲除质粒的提取及验证 11

2.2.3 节杆菌感受态制备及电转 12

2.2.4 双交换重组子筛选 13

2.2.5 敲除目的基因菌株的验证 14

2.2.6重组菌发酵 14

2.2.7改造后节杆菌的发酵实验 15

2.2.8发酵液的处理方法及cAMP检测 15

第三章 结果与讨论 18

3.1结果与讨论 18

3.1.1不同菌株cAMP合成能力比较 18

第四章 结论与展望 20

4.1结论 20

4.2展望 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 前言

1.1 cAMP研究背景

1.1.1 cAMP简介

环腺苷酸(Cyclic adenosine monopHospHate，简称为cAMP)是一种具有细胞内信息传递作用的小分子，被称为细胞内信使(intracellular messenger)或第二信使^[1](second messengers)。以微量存在于动植物细胞和微生物中。体内多种激素作用于细胞时，可促使细胞生成此物，转而调节细胞的生理活动与物质代谢。信使指可以在体内传递信号,引起细胞基因表达变化的小分子们.有人称其为细胞内的第二信使，而称激素为“第一信使”。环腺苷酸之所以称为细胞内的第二信使，是由于某部些激素或其它分子信号刺激激活腺苷酸环化酶催化ATP环化^[2]形成的。20世纪50年代，萨瑟兰发现环磷酸腺苷^[3]，以后有阐明了cAMP是寄宿在细胞内起作用的“第二信使”。1971年获诺贝尔生理学或医学奖。美国哥伦比亚大学坎德尔教授通过研究得出结论：cAMP在修复脑细胞、活化脑细胞、调节脑细胞功能方面有非常重要的作用，使短时记忆转变为长时记忆，并缓解脑细胞的疲劳，延缓脑细胞的衰老。因此获得2000年的诺贝尔医学奖。

1.1.2 cAMP的作用

环磷酸腺苷(cAMP)是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是生命信息传递的“第二信使”。在体内可以促进心肌细胞的存活，增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和缺氧能力;促进钙离子向心肌细胞内流动，增强磷酸化作用，促进兴奋-收缩偶联，提高心肌细胞收缩力，增加心输出量；同时还扩张外周血管，降低心脏射血阻抗，减轻心脏前后负荷，增加心排出量，改善心功能。从而对心脏起到营养心肌、正性肌力、舒张血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用。在临床上主要用于治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死。尤其是对洋对黄类强心药中毒或不敏感的患者。进入细胞的环磷腺苷在发挥生物学效应后被磷酸二酯酶降解成5-腺苷-5′-磷酸(5-AMP)失去活性，进而被分解成腺苷和磷酸。为蛋白激酶致活剂，系核苷酸的衍生物。它是在人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成，能调节细胞的多种功能活动。作为激素的第二信使，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢作用，能改变细胞膜的功能，促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维，从而增强心肌收缩，并可促进呼吸链氧化酶的活性，改善心肌缺氧，缓解冠心病症状及改善心电图。此外，对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。

1.1.3 cAMP在畜牧业中的应用

cAMP能提高动物的生产性能和改善畜产品品质。其作用机理为：cAMP作为激素的第二信使激活蛋白激酶，使代谢酶活性增强，从而加强体内蛋白的合成，增快动物的生长速度；诱导激素（如生长激素等）或酶的合成，促进机体的合成代谢。
环腺苷酸在肉畜生产上的应用大量试验结果表明，cAMP对猪、羊、兔等生长性能和胭体品质影响一致，高水平cAMP能引起脂肪组织中HSL活化而使脂肪分解能力加强。同时cAMP还可减少胰岛素与脂肪细胞的结合^[4]，以对抗胰岛素对体脂沉积的促进作用。杨在清等给猪皮下注射cAMP或氨茶碱（PDE抑制剂），结果不但改善了胭体组成，提高了瘦肉率、眼肌面积和后腿比，而且还使血中脂质含量和脂肪酶的活性升高。提示体脂降低和血脂升高可能与cAMP的作用使体内脂肪酶活性升高引起体脂动员有关，而体脂的大量分解利用有利于降低蛋白质的分解，从而加强蛋白质在体内的沉积。cAMP对幼龄家畜也有明显的促生长作用。据报道，给仔猪、羔羊和仔兔注射cAMP制备品和标准品制剂，有显著促生长作用。李自新等对肉用仔兔注射cAMP有明显的增重效果，但随着使用时间的延长其效果有所下降。另外，cAMP能显著提高羊的产毛量和毛纤维长度，改变羊毛中各种氨基酸的含量。环腺苷酸在奶富生产上的应用 人们通过对大鼠、小鼠、豚鼠、兔和奶畜（奶牛、奶羊）等动物乳腺和乳中cAMP的研究，发现cAMP在泌乳生理过程中起着重要作用。据报道了不同泌乳阶段山羊乳中环腺奇酸的变化，分娩前波动木大，分娩后急剧升高；泌乳维持期，分娩后15d乳中cAMP浓度一直维持在较高水平；在泌乳高峰期，cAMP有所升高；泌乳减退期，停止挤奶前1个月左右羊只妊娠，产乳量显著下降，乳中cAMP大幅度下降。他们认为cAMP主要促进乳汁分泌，cGMP主要促进乳汁生成，二者呈一种消长变化。据报道，在一定浓度范围内，cAMP对体外培养的山羊乳腺上皮细胞增殖有促进作用，并呈剂量依赖性，但cAMP浓度过高时则有抑制作用。cAMP是如何调控乳腺细胞中生乳、泌乳活动的，目前尚不十分清楚。

1.1.4cAMP在家禽生产中的作用

外源性cAMP可显著促进艾维茵肉仔鸡生长，提高胸肌率、腿肌率，降低腹脂率，而且随着剂量的增加而增大。环腺苷酸还对肉鸡代谢有影响，可降低肉中的脂肪沉积，促进蛋白质积累，对肝脏组织也有类似的效果。cAMP对禽类脂肪代谢的作用和哺乳类动物有所不同。cAMP能促使哺乳类动物的激素敏感脂酶（HSL）活性升高，促进机体脂肪分解和血脂含量升高，从而降低肉中的脂肪沉积，改善胭体品质，而在家禽中胰高血糖素才是主要的脂解激素。研究表明，外源性环腺苷酸对肉鸡体内的GH的分泌、代谢有一定的促进作用，并在试验组生长明显快于对照组的情况下，死亡率却低于对照组，这可能与cAMP对肉鸡心血管系统具有调节作用有关，另一方面与血清中蛋白质含量显著高于对照组，尤其是球蛋白增加有关。cAMP还可显著提高蛋鸡的产蛋性能，改善蛋壳的品质^[5]。

1.1.5 cAMP的巨大价值

cAMP是多种激素作用的第二信使，具有广泛的营养代谢调节作用，是动物生长的重要调节因子，具有来源广、提取和制备方便等优点，但目前的研究主要集中在医学领域，其次是体外试验，而用于动物体内的试验研究较少，因此有必要进行更多更深入的研究。从现有的研究结果看，cAMP能促进蛋白合成，减少脂肪沉积。这正符合了当前人们的饮食习惯，减少了脂肪和胆固醇的摄入量，从而减少了患各种心血管疾病如冠心病、动脉硬化等的可能。同时在机体内影响cAMP代谢的因素极其复杂，其信号通路过程中除涉及其代谢调节酶外，还涉及细胞信号传递中的一系列因子，因此加深对其具体作用的了解也有助于利用外源性cAMP诊断疾病、控制肿瘤细胞生长、抗动脉粥样硬化以及提高机体免疫力等。

1.2 cAMP的制备方法

同许多精细化学品一样，cAMP的生产方法可以分为化学合成法、酶法和发酵法。

1.2.1 化学合成法

自从1957年Sutherland等人发现cAMP以来，国内外学者就陆续报道了从不同原料出发，采用不同化学合成工艺路线生产cAMP。

1961年Smith等人^[6]采用DCC脱水法合成cAMP。此法主要是以5’-腺苷酸和4-吗啡啉-N，N’-二环己基脒为原料，吡啶作为溶剂，DCC（Dicyclohexyl-Carbodiimide）作为脱水剂进行脱水反应，使5’-腺苷酸发生内酯化而产生cAMP。为避免分子间反应，反应必须在高度稀释条件下进行，因而需要耗费大量的无水吡啶。吡啶有强烈特殊臭味，对皮肤和呼吸道有刺激性，对人体危害很大，并造成严重的环境污染。

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