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摘 要

谷氨酸棒杆菌是广泛应用于氨基酸及其他重要化学品发酵生产的工业微生物，本论文在前期利用谷氨酸棒杆菌构建L-瓜氨酸和L-精氨酸生产菌株的研究中，发现由氨甲酰磷酸合成酶固定CO2合成的氨甲酰磷酸，对菌体生长和L-瓜氨酸和L-精氨酸合成代谢起重要作用。氨甲酰磷酸作为精氨酸和嘧啶合成代谢的关键节点，其研究报道相对较少。本论文为研究认识氨甲酰磷酸合成与分解代谢在强化谷氨酸棒杆菌固定CO₂并在调控L-瓜氨酸、L-精氨酸与嘧啶合成代谢中的关键作用规律，从调控角度系统解析氨甲酰磷酸合成与分解代谢关键酶表达强度对碳代谢流分布的影响，阐明氨甲酰磷酸关键节点的控制规律及胞内能量变化，从而确定最优的氨甲酰磷酸途径多基因协同表达体系以提高单位菌体的L-瓜氨酸合成。

关键词：谷氨酸棒杆菌；氨甲酰磷酸途径；精氨酸合成代谢；代谢调控

ABSTRACT

Corynebacterium glutamicum is one of the optimal industrial microorganisms to produce amino acids. In the early study of constructing the L-arginine and L-citrulline strains, the applicant has found that the carbamyl phosphate synthesized by glutamine through phosphate transfer and CO2 fixation catalyzed by carbamyl phosphate synthesatase played an important role in the growth of cells and the anabolism of arginine. Carbamyl phosphate is the key node of the anabolism of arginine and pryrimidine, while its in-deepth researches and the synthesis study about the arginine series of amino acid are still in the blank. This study will research the function and pattern of the synthesis and metabolism of carbamyl phosphate in strengthening CO2 fixation and regulating the anabolism of arginine and pryrimidine. Using the Corynebacterium glutamicum of producing L-arginine and L-citrulline, we will ascertain the optimal expression level to improve the unit yield by studying the influence of the flow of carbon metabolism caused by different expression level of enzymes, the pattern of key node and the transformation of energy in cells. This study will provide the theory gist about the flow of carbon metabolism regulated and controlled by carbamyl phosphate and offer the guidance to high-efficient production of L-arginine and L-citrulline.

Key words: Corynebacterium glutamicum ;carbamyl phosphate pathway ;arginine anabolism;metabolic regulation

目录

摘要 II

ABSTRACT III

目录 IV

第1章 绪论 1

1.1 谷氨酸棒杆菌研究背景 1

1.2 国内外谷氨酸棒杆菌氨甲酰磷酸途径研究概况 3

1.3 本文的研究目的和研究内容 5

1.3.1 本文的研究目的 5

1.3.2 本文的研究内容 5

第2章 材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.2.1 实验仪器 6

2.2.2 实验试剂 7

2.2.3 菌株与质粒 8

2.2.4 培养基及培养条件 8

2.2 实验方法 9

2.2.1 基因工程操作方法 9

2.2.2 主要的分析方法 10

第3章 结果与讨论 12

第4章 结论与展望 14

参考文献 15

致谢 18

第1章 绪论

1.1 谷氨酸棒杆菌研究背景

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为重要的工业微生物，已被广泛应用于发酵工业、生物催化和环境治理等领域，尤其用于氨基酸的发酵生产已有60多年的历史，已报道的产量最大的氨基酸如L-谷氨酸、L-赖氨酸全部由C. glutamicum的突变株生产得到。以C. glutamicum ATCC 13032为代表的多株谷氨酸棒杆菌基因组测序的完成为利用系统代谢工程与合成生物学技术对菌株进行设计与改造提供了大量的信息和技术支持，通过分析基因组网络信息，界定物质与能量代谢的功能模块，找出与目的产物积累相关的途径及关键酶，设计并优化人工合成目标，在谷氨酸棒杆菌底盘细胞中系统进行检测评价及功能替换，获得代谢途径的最佳物质流、能量流与信息流分布，可以最大化积累目的产物，从而构建出具备理想特征的谷氨酸棒杆菌细胞工厂，现在已有许多成功的实例。

L-精氨酸系列氨基酸主要包括L-精氨酸、L-鸟氨酸和L-瓜氨酸，在人体内同时参与尿素循环，对维持哺乳动物细胞环境中铵离子浓度起着非常重要的作用。L-精氨酸系列氨基酸具有重要的生理作用，已被广泛用于医药领域和食品工业，具有良好的市场前景。发酵法已在L-精氨酸的工业生产中广泛应用， L-鸟氨酸和L-瓜氨酸发酵法通常采用精氨酸缺陷型菌种，在已有精氨酸高产菌基础上筛选精氨酸缺陷型可以随机得到瓜氨酸或鸟氨酸高产菌株，但采用传统诱变法随机型较大，不易得到高产菌种，尤其是瓜氨酸高产菌株筛选条件更加难以确定。

在原核微生物中精氨酸合成途径经谷氨酸出发经历了8种酶催化而成，鸟氨酸和瓜氨酸作为中间产物分别了经历5步和6步反应催化生成。在C. glutamicum中精氨酸的合成采用乙酰鸟氨酸转移酶只具有脱下乙酰基团功能的经济循环途径，即乙酰鸟氨酸在由argJ基因编码的乙酰鸟氨酸转移酶的作用下形成鸟氨酸的同时，乙酰基团被转移到谷氨酸形成乙酰谷氨酸。其中循环途径中乙酰鸟氨酸转移酶的的功能又可分为两类，单功能类即乙酰鸟氨酸转移酶只具有脱下乙酰基团的功能，和双功能类即乙酰鸟氨酸转移酶不但具有脱下乙酰基团功能，还有把乙酰基团转移到谷氨酸上形成乙酰谷氨酸的功能，被L-精氨酸反馈抑制的关键酶是N-乙酰谷氨酸激酶（argB编码）。2009年，日本Ikeda M等在对C. glutamincum A-27、I-30、D-77等菌株中argB、argR、argG的基因序列分析的基础上对C. glutamincum A-27菌株进行代谢改造，对argB基因定点突变的同时敲除了argR基因，构建了重组菌RBid，其发酵精氨酸产量可达80 g/L，为现有报道的最高值。国内江南大学饶志明教授课题组在钝齿棒杆菌中精氨酸合成途径调控机理方面进行了较深入的研究，通过产物反馈抑制的分子改造等一系列代谢工程改造，获得了国内产量最高的精氨酸生产菌株。

课题组前期研究以谷氨酸棒杆菌标准菌株C. glutamicum ATCC 13032和有自主知识产权的C. glutamicum 1006为研究对象，采用代谢工程策略，构建了L-瓜氨酸生产菌株并初步进行了代谢流分析，结果显示由CO₂与谷氨酰胺经氨甲酰磷酸合成酶（UPS）固定反应合成的氨甲酰磷酸，对L-精氨酸和L-瓜氨酸的生物合成起重要作用。目前，关于谷氨酸棒杆菌氨甲酰磷酸合成与分解代谢的研究报道还较少，基于该途径指导精氨酸系列氨基酸的合成仍处于空白。氨甲酰磷酸作为重要的高能磷酸化合物及精氨酸和嘧啶合成所必需的前体物质，系统解析其途径与调控机制，对进一步优化谷氨酸棒杆菌作为底盘细胞合成精氨酸系列氨基酸及其衍生物具有重要的理论意义与应用价值。

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