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摘 要

猪肝酯酶是一种重要的羧基酯酶，因其具有高选择性的特性，被广泛的应用于有机化合物的动力学拆分及去对称反应，具有重要的工业价值。为此本实验以Pet-22b质粒为载体，以大肠杆菌为宿体，构建了重组质粒，并导入BL21感受态细胞，同时对其诱导温度，诱导时间等条件进行优化，以促使蛋白正确折叠，提高蛋白的表达量及酶活。实现猪肝酯酶在微生物中的异源表达。并通过条件优化得出在最适温度为30℃，最适诱导时间为18 h, 最适诱导剂添加量为0.8 mmol/L下，用pNPP法测酶活为120U/L。

关键词: 猪肝酯酶；质粒；条件优化；大肠杆菌

Study on the Heterologous Expression of Pig Liver Esterase in Escherichia coli

Abstract

Pig liver esterase is a kind of important carboxylic esterase, It's widely used in kinetic resolution of organic compounds and symmetric reaction by its characteristics of high selectivity and has important industrial value. Therefore the experiment on the carrier of Pet-22b plasmid, at the same time, the induction temperature and the time of induction are optimized to promote the protein correct fold, improve the expression of protein, enzyme activity and the pig liver esterase in the microbial heterologous expressed. And by optimizing the conditions obtained in the optimum temperature of 30 ℃, the optimal induction time is 18 h, The optimum inducer adding amount 0.8 mmol/L, with pNPP method of measuring enzyme activity was 120U/L.

Key Words: Pig Liver Esterase; plasmid; Conditions optimization; Escherichia coli

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1猪肝酯酶的简介 1

1.2对猪肝酯酶的研究进展 1

1.3研究目的与内容 2

第二章 实验材料和实验方法 3

2.1实验材料 3

2.1.1 试剂 3

2.1.2 主要仪器 3

2.1.3 菌株、质粒 4

2.1.4 LB培养基 4

2.1.5 溶液的配制 4

2.1.6 蛋白电泳实验准备 5

2.1.7目的基因条件优化 6

2.2实验方法 6

2.2.1蛋白电泳步骤如下： 6

2.2.2 AxyPrep DNA凝胶回收 7

2.2.3 pNPP法测酶活 8

第三章 实验结果与讨论 9

3.1基因表达质粒Pet-22b-PLE的构建 9

3.2重组质粒验证 13

3.3突变后的基因序列 13

3.4重组质粒导入BL21(DE3)及诱导表达 15

3.5 pNPP法测酶活 15

3.6目的基因的条件优化 16

第四章 实验结论与展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

1.1猪肝酯酶的简介

猪肝酯酶 (Pig Liver Esterase，简称PLE) 是一种从猪肝中提取出来的能选择性水解羧酸酯，由于其具有很强的手性选择能力，已广泛应用于光学活性醇或羧酸的合成^[1]。猪肝酯酶的生化提取物分子量在16300-16800 Da之间并且由α，β，γ三种同工酶组成的复合物。其中α-PLE同工酶以催化酰基为长链脂肪酸的羧酸酯为主，γ-PLE同工酶则主要催化酰基为芳环的羧酸酯^[2]。现在商业上一般以“PLE”表示自然提取而未经分离的PLE同工酶混合物，经分离和提纯得到的PLE中的两种单一酶组分各以chiraxymeE-1和ChirazymeE-2表示^[3]。

表1-1 PLE三种单体的生化性质比较^[4]

1.2对猪肝酯酶的研究进展

从20世纪60年代起就开始，人们就研究作为羧酸酯酶中的一员的PLE。之前人们以生化提取为主，到2001年Lange.stephen等^[5,6]用Invitrogen公司提供的甲醇酵母表达型试剂成功得到一种PLE一脯氨酸一β一蔡胺酶， 实现了巨大飞跃。同时经过Genbank序列, 发现与另一种从猪小肠得到的猪肠甘油酯水解酶同源性高达97%。现在, PLE与马肝乙醇脱氢酶(HLADH),以及面包酵母已被发展于手性催化工业中。

据报道发现，PLE对于有机合成而言是重要的一种酶。并且因其反应条件温和，具有高区域选择性和对映选择性，所以被广泛应用于有机化合物的动力学拆分及去对称反应^[6]。Hans-Joachim Gais等^[7,8]研究发现猪肝酯酶在有机溶剂中几乎没有活性。但是，MPEG、BSA及TGA等的添加可以使其在有机溶剂中表现出生理活性。同时猪肝酯酶对于前手性化合物的选择性水解或外消旋而言也是一种重要的酶。

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