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摘 要

丁二酸是一种被应用很广的含有4个碳的化合物，被广泛应用于制备药物、精细化工产品以及可生物降解的聚合物。大肠杆菌 AFP111是敲除葡萄糖转运蛋白（ptsG）系统，乳酸脱氢酶（ldh）和丙酮酸甲酸裂解酶（pfl）的厌氧发酵产丁二酸的菌株，通过对三个基因进行敲出，使得葡萄糖生成乳酸和乙酸的代谢通路被阻断，限制了它们的合成与积累；在此基础之上，通过高拷贝质粒pTrc99a过量表达枯草芽孢杆菌中的琥珀酸脱氢酶sdh，从而使得丁二酸的产量进一步提高。在整个发酵体系中，以葡萄糖为原料进行丁二酸发酵时，一分子葡萄糖经过EMP途径产生2个电子，而产生1分子丁二酸需要消耗4个电子，为了提高胞内可用电子的含量，促进丁二酸的合成，一方面表达琥珀酸脱氢酶，增加富马酸的还原效率，另一方面试图通过电化学系统外源供给电子，促进NADH的再生，进一步提高菌体丁二酸的合成。

发酵结果表明，过表sdh后，菌株的生长明显优于出发菌株，但厌氧发酵产丁二酸的水平受到明显限制，其原因可能是由于辅酶的不平衡导致的。

此外，通过对比发酵实验发现，电化学系统可以为细胞生长及代谢提供额外的电子，增加NADH的总量及NADH/NAD 的比例，这在一定程度上有利于丁二酸的合成，但是增加的还原力扰乱了胞内辅酶平衡，限制了菌株的生长。

关键词：AFP111 厌氧发酵 丁二酸 生物电化学系统

Improve succinic acid synthesis in E.coli AFP111 by electrochemical system

Abstract

Succinic Acid is a very broad application of C4 compound, is widely used in the preparation of pharmaceutical, fine chemical products and biodegradable polymers. , E.coli AFP111 is a strain that knocked out the glucose transportation systemptsG, lactate dehydrogenase ldh and pyruvate formate lyase pfl, so the pathway of glucose to lactic acid and formic acid is blocked, and there is no accumulation of these two organic acid.In my experiment, overexpression of SDH(succinate dehydrogenase) by pTrc99a,which can catalyze fumarate reduction .under anaerobic condition,The EMP pathway can generate two electrons, but for succinate synthesis, it will need to consume four electrons, in order to increase the intracellular electron, improve the synthesis of succinate, I try to give cell more electron byelectrochemical system,in this way,the regeneration of NADH will be benefit to succinte synthesis.

Fermentation results showed that when SDH is overexpressed, the growth of the strain was significantly better than the original strain, but the level of succinic acid is limited, that may be due to an imbalance of coenzyme. By comparison, electrochemical system can increase the reducing power levelsat a certain extent, and will increase the synthesis of succinic acid, but the increase in reducing power level will limit the growth of bacteria.

Key words:AFP111;Anaerobic fermentation;Succinate;Bio-electrochemical system

目录

摘 要 Ⅰ

Abstract Ⅱ

第一章 前 言 1

1.1 课题研究背景 1

1.2 课题的研究目的和意义 3

1.3 课题采用的研究手段 4

第二章 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.2 实验方法 11

第三章 结果与讨论 16

3.1菌种构建鉴定 16

3.2 IPTG浓度优化 17

3.3 AFP111 -AFP111-sdh 厌氧发酵 17

3.4 AFP111 电化学和恒化器发酵 18

3.5 AFP111-sdh 电化学和恒化器发酵 18

3.6 AFP111和AFP111-sdh的电化学和恒化器发酵NAD（H）的测定 19

第四章 总结与展望 21

参考文献 22

致 谢 24

第一章 前 言

1.1 课题研究背景

丁二酸,又称琥珀酸,遍及动植物和微生物体内,它是生物进行三羧酸循环的中间产物之一。它是一种可应用于多种领域重要的有机合成中间体。

目前生产丁二酸，大多是用化学合成的方法，从丁烷合成顺式丁烯二酐来直接生成琥珀酸。此方式生产成本高,且对环境污染严重,这极大的制约了琥珀酸的广泛利用。于是，人们使用微生物发酵法来生产琥珀酸。并且微生物发酵生产琥珀酸可以利用可再生资源糖和二氧化碳等为原料,不仅减少了对石油化工原料的依赖,而且能够固定二氧化碳,增加了绿色环保。

1.1.1 化学合成法

化学方法是工业生产丁二酸的主要方法，有相对较成熟的生产工艺。催化加氢法是目前使用比较广泛的，在130～140℃的条件下，以镍或贵金属为催化剂，顺丁烯二酸酐或反丁烯二酸的加氢反应，生成丁二酸。此方法丁二酸收率为 90%，产品纯度良好^[2]。

此方式获取丁二酸，不但底物和催化剂的代价高，而且对石化原料需求量大，这些原料是不可再生的，这对于日趋干涸的石油资源是相当不利的，而且它的生产过程还会对环境造成威胁。

1.1.2 生物转化法

该方法主要是指以富马酸还原酶为催化剂，将富马酸还原为丁二酸。^[3]

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