论文总字数：17619字

摘 要

N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶是一种具有拆分效果的立体拆分酶，尚未被开发利用。菌种室保藏有不同构建方式及批次的高表达N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的重组菌，由于历史原因，存放较为混乱，活力数据也不太清晰。本文首先对不同批次的保藏菌株进行整理、筛选及再保藏，并登记在册，再以筛选出的高活力株为出发株优化了酶表达条件。 结果重组菌DH10B/pHsh-argE的酶活力高于pET22b-argE-BL21，热激启动子的最佳热激温度为40℃。重组菌在20℃，150 r/min振荡培养6h后在40℃热激时间5小时酶活性最高。

关键词：N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶，筛选，保藏，表达优化

Abstract

N-acetylornithine deacylase is a kind of split enzyme and has three-dimensional split effect,which has not yet been exploited.Species preservation chambers are built differently and have lots of high expression N-acetylornithine deacylase of recombinant bacteria, due to historical reasons, the store is more chaotic, dynamic data is not clear. Firstly, different batches of the deposited strain organize, preservation and re-screened and registered, and then to filter out the high dynamic strain as the starting enzyme expression strain optimized conditions. Results The recombinant strain DH10B/pHsh-argE enzyme activity higher than pET22b-argE-BL21, heat shock promoter, heat shock optimum temperature is 40 ℃. After the recombinant bacteria in 20 ℃, 150 r / min after shaking culture 6h and 40 ℃ heat shock time of 5 hours, the activity of the enzyme is the highest.

Key words: N - acetylornithine Deacylase，Screening，preservation， expression optimization

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 III

第一章 绪 论 5

1.1 氨基酸的手性拆分及N-乙酰鸟氨基酸脱酰基酶 5

1.2 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的酶学性质 6

1.3 重组菌的表达条件优化 7

1.4 本课题研究意义和内容 8

第二章 乙酰鸟氨酸脱酰基酶的筛选 9

2.1试剂和仪器 9

2.1.1 试剂 9

2.1.2 主要仪器 10

2.1.3 实验菌种 10

2.1.4 培养基 10

2.1.5酶作用底物N-乙酰-D,L-蛋氨酸的精制及溶液配置 10

2.1.6 东存管用甘油溶液的配置 11

2.2 实验方法 11

2.2.1重组菌pET22b-argE-BL21筛选 11

2.2.2 DH10B/pHsh-argE筛选 11

2.3分析方法 12

2.3.1 生物量 12

2.3.2 pH值 12

2.3.3菌种形态观察 12

2.3.4 酶活测定方法 12

2.4菌种的冻存 12

2.5 结果与讨论 13

2.5.1蛋氨酸的标准曲线 13

2.5.2 pET22b-argE-BL21菌筛选结果 13

2.5.3 DH10B/pHsh-argE菌筛选结果 16

第三章 N-乙酰鸟氨酸脱酰基酶的表达优化 18

3.1 引言 18

3.2实验过程 18

3.2.1 主要试剂及原料处理 18

3.2.2 实验菌种及培养基 19

3.2.3 改变热激温度 20

3.2.4 改变起始OD时间 20

3.2.5 改变热激时间 20

3.3分析方法 20

3.4结果与讨论 21

3.4.1改变热激温度 21

3.4.2改变起始OD时间 22

3.4.3改变热激时间 23

第四章 结论与展望 25

4.1实验结论 25

4.2展望 25

致谢 26

参考文献 27

第一章 绪 论

1.1 氨基酸的手性拆分及N-乙酰鸟氨基酸脱酰基酶

随着人类自身需求的增加和科技的发展，氨基酸的应用领域被不断的扩大。具有光学活性的手性氨基酸在蛋白质多肽合成、有机化学不对称合成以及医药、食品、卫生等领域具有重要意义，更是有着重要的生物活性和独一无二的生理作用。

用酶法拆分外消旋体具有绿色环保、反应条件温和、收率高等优点，特别对于L型和D型都有价值的氨基酸而言，更具有应用前景。N-乙酰鸟氨基酸脱酰基酶（N-acetylornithine deacetylase,简称NAOase；EC3.5.1.16)就是一种较为有效的拆分手性氨基酸的酶。它可以催化乙酰鸟氨基酸转化成乙酸和鸟氨基酸，在大肠杆菌体内的从谷氨酸到精氨酸的生物合成途径中起着重要的作用；在体外亦能催化N-乙酰蛋氨酸、N-乙酰丙氨酸、N-乙酰亮氨酸等其他酰基化的氨基酸^[1-4]。用基因工程菌表达的脱乙酰基酶法拆分活性更高、酶源易得，成本更低，原则上拆分效能更好。

N-乙酰鸟氨基酸脱酰基酶具有一定的工业应用价值，因此研究N_乙酰鸟氨基酸脱酰基酶的结构特性，通过酶分子改造提高其活性，对构建新型产NAOase的重组菌和扩大其工业应用领域具有重要的理论价值和实际意义。

1953年，Henry 等阐明了E. coli.内鸟氨酸的生成途径，即从谷氨酸开始经乙酰谷氨酸，乙酰谷氨酸半醛到乙酰鸟氨酸，乙酰鸟氨酸再脱酰基生成L-鸟氨酸。此反应途径也是E. coli. 内鸟氨酸合成的唯一途径。催化乙酰鸟氨酸脱酰基的酶兼具乙酰酶和肽酶的活性，呈现出转氨酶的活性，无机磷酸和Co² 能促进此步反应。该酶最初被命名为乙酰鸟氨酸酶（acetylornithinase），催化的反式为：

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