论文总字数：16778字

摘 要

多肽疫苗拥有免疫应答能力，生产安全，高度标准型，还原性低等优势，现已成为疫苗研究热门之一。GV1001是一种主要用于治疗胰腺癌的多肽疫苗，并且可适用于多种肿瘤的治疗。

本实验采用反相高效液相色谱法建立和优化GV1001与其相关杂质的分离方法。分析条件为：水与乙腈1:1的溶剂溶解样品；Kinetex Evo C18（250 mm×4.6 mm，5μm，pH1.5-10）色谱柱；流动相A为35mmol·L^-1的醋酸铵缓冲液（pH6.5），流动相B为乙腈；流速：1 ml·min^-1；洗脱梯度：B%：5%→22%(0-30min)，22%-22%(30-60min)；进样体积：20μL；检测波长：UV214nm；柱温为室温。实验对所建立的方法进行了方法学考察，通过考察系统精密度得出，主峰的峰面积和保留时间的RSD值分别为0.689%和0.613%，可见本实验分析系统有较高的精密度。稳定性实验中，样品在24h内的峰面积的和保留时间的RSD值分别为0.11%和2.3%，表明GV1001样品溶液在24h内稳定性良好。通过上述HPLC条件考察线性关系，样品溶液在0.25~4 mg/ml浓度范围内，GV1001峰面积A和浓度成良好的线性关系，R²=0.9991。

将分析方法应用到制备色谱中，制备条件为： AKTA explorer100色谱仪；制备柱：SinoChrom ODS-BP(10μm, 30×250 mm)；流动相A：35mmol·L^-1乙酸铵缓冲液（pH6.5）；流动相B：乙腈；流速：30 ml·min^-1；检测波长：UV214nm；洗脱梯度：B%： 10%→20%(0-30min)，20%-22%(30-62min)；温度：室温；进样量：0~100mg。使用上述方法对GV1001制备，实现了GV1001多肽疫苗的分离纯化。

关键词：GV1001 反相高效液相色谱 多肽药物 分离纯化

Isolation and purification of GV1001 peptide vaccine by High performance liquid chromatography

Abstract

Polypeptide vaccine with immune response ability, production safety, high standard, reducing low advantage, has become one of the hotspots in vaccine research. GV1001 is a kind of polypeptide vaccine which is mainly used for the treatment of pancreatic cancer, and it can be used in many kinds of tumors. Separation method of GV1001 and its related impurities was established and optimized by reverse phase high performance liquid chromatography. Analysis: water and acetonitrile 1:1 solvent to dissolve the sample; Kinetex Evo C18（250 mm×4.6 mm，5μm，pH1.5-10）column; mobile phase A: 35mmol·L^-1 ammonium acetate buffer (pH 6.5) and mobile phase B:

acetonitrile: flow rate: 1ml·min^-1;gradient elution: B%：5%→22%(0-30min), 22%-22%(32-60min);sample size: 20μL,and the detection wavelength:UV214nm; column temperature: room temperature. The method is studied by experiment, through the investigation of the system precision showed that the RSD% value of main peak of the peak area and retention time are 0.689% and 0.613% separately. It shows that the system has high precision. The stability of samples showed within 24 hours, the RSD% value of sample’s peak area and retention time are 0.11% and2.3% separately, which means the GV1001 sample solution has good stability in 24h. Though the linear relationship investigated by High Performance Liquid Chromatography analysis of the above conditions, concentration and peak area A into good linear relationship when sample solution in the range of 0.25~4mg/ml concentration, R²=0.9991.

Analysis methods previously applied to the preparation of chromatography and preparation conditions for the instrument: AKTA explorer100; preparation column: SinoChrom ODS-BP(10μm, 30×250 mm); mobile phase A: 35mmol·L^-1 ammonium acetate buffer (pH 6.5); mobile phase B: acetonitrile; velocity: 30 ml·min^-1. The detection wavelength: UV214nm; gradient elution: B%: 10%→20%(0-30min), 20%-22%(30-62min); temperature: room temperature; amount of sample: 0~100mg. Using the above method, the preparation of GV1001 and the isolation and purification of GV1001 polypeptide vaccine were realized.

Key Words: GV1001; RP-HPLC; Peptide drugs; Separation and purification

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1.多肽药物 1

1.1.1.多肽药物的简介 1

1.1.2.多肽疫苗 1

1.1.3.GV1001多肽疫苗 2

1.2.多肽药物的分离纯化 2

1.2.1.离子交换色谱法 2

1.2.2.凝胶色谱法 3

1.2.3.反相高效液相色谱法 3

1.3.多肽的HPLC制备 4

1.4.小结 5

第二章 实验方法 6

2.1实验试剂和仪器 6

2.2溶液配制 6

2.2.1样品溶液的配制 6

2.2.2流动相的配制 7

2.3色谱条件 7

第三章 结果与讨论 8

3.1 最佳分离条件的选择 8

3.1.1检测波长的选择 8

3.1.2最佳溶剂的选择 8

3.1.3色谱柱的选择 8

3.1.4流动相PH的选择 8

3.1.5缓冲盐浓度的选择 9

3.1.6最佳柱温的选择 10

3.2方法学的考察 10

3.2.1精密度 10

3.2.2线性考察 10

3.2.3检测限，定量限 11

3.2.4稳定性 11

3.3 GV1001的制备 11

3.3.1制备色谱条件的转换 11

3.3.2制备色谱条件和制备结果 12

第四章 结论与展望 15

4.1 结论 15

4.2展望 15

参考文献 17

致谢 19

第一章 文献综述

1.1.多肽药物

1.1.1.多肽药物的简介

多肽是一种化合物，一般由50到100个氨基酸分子通过肽键相连而成，大多数多肽的分子量低于10000，并且种类多种多样^[1]，仅生物体中发现的多肽种类就有数万中，广泛参与和调节机体各种功能活动，对生命活动发挥巨大的作用。随着研究的深入，人们发现多肽药物的用量小, 生物活性强于传统药物，对一些如癌症、自身免疫性疾病、记忆力减退、精神失常、高血压、肝炎、糖尿病、艾滋病等难以治疗的疾病的预防、诊断和治疗起到显著的效果。如今，人们可以利用多种生物技术相结合的方法合成出多肽药物，此类多肽药物能克服许多传统药物难以攻克的疑难杂症，它的种种优势让其成为当今药物开发的热点^[2]。

多肽分为内源性和外源性肽，多肽类药物主要是来源于内源性肽和一些天然多肽，它的活性与蛋白质药物相近，并且作用机制明确，结构清晰，质量控制水平与小分子化学药物相近，某些活性多肽甚至可由人工利用计算机进行设计与修饰，经合成获得^[3]。多肽药物的分子结构较小，合成和改造易于实现^[4]，无需大型装置，普通大型实验室即可满足生产。由于它生产过程排废少，并且能适用于传统化学药物无法治疗的某些疾病，因此作为绿色制药，成为如今最有发展前途的药物之一^[5]。

1.1.2.多肽疫苗

多肽疫苗是通过现代技术化合而成的疫苗，且不存在灭活不全的问题，它是多肽类药物的典型代表。如今，多肽疫苗以其良好的药效赢得科研者们的认可，人们正在此领域投入大量资源进行研究和开发。早在20世纪80年代，有研究人员了解到口蹄疫病毒的某些氨基酸肽段具有免疫性位点。多肽疫苗具有以下优势：生产安全且合成效率高；副作用小；活性高；具有免疫应答的能力；缺乏具有高反应原性的成分等。目前，进入临床研究的多肽疫苗有抗艾滋多肽疫苗，抗肿瘤多肽疫苗，抗孕多肽疫苗等^[6]。随着科学技术的进步，对多肽疫苗的研究将进一步深入，并不断完善其免疫原性欠佳、免疫应答和临床反应不一致^[7]等问题。在抗病毒多肽疫苗方面，人类免疫缺陷病毒多肽疫苗Vacc-4x表现出可降低病毒载量，对实现HIV的治疗提供研究基础；乙型肝炎病毒多肽疫苗是如今预防和控制乙肝最有效的方法之一。而在抗肿瘤方面，多肽疫苗在临床方面对某些恶性肿瘤取得较好的效果，它可以结合MHC一类分子，并识别肿瘤抗原，随后呈现给T或B淋巴细胞，达到CD8阳性T细胞的增值和免疫应答，最终起到对抗肿瘤细胞的目的。多肽疫苗的这些独特的优势使其具有较好的前景。

1.1.3.GV1001多肽疫苗

GV1001是由韩国凯尔-GemVax公司研究开发的胰腺癌多肽疫苗（英国癌症研究中心提供资金），它能够表达胰腺癌中测出的hTERT^[8]亚基611—626位氨基酸的肽段。GV1001是唯一进入临床阶段的基于端粒酶的II类多肽疫苗，其主要功能是激发 CD₄ 和 CD₈ 应答,产生CD₄ 是Ⅱ类多肽免疫最重要的生物学优势，特别是对于Thl(Th1细胞主要介导细胞免疫应答，主要分泌白细胞介素2，干扰素γ等细胞影子)亚型的增殖是很必要一点，使能够产生强烈的细胞毒性T淋巴细胞应答^[9]。对于GV1001的临床研究，早在2006年10月，有关治疗胰腺癌的I／II期临床试验结果被发表，肯定了GV1001对治疗胰腺癌有显著疗效，并且很可能适用于多种肿瘤。据I／II 期临床试验结果，GV1001具有高安全性和免疫应答能力，GV1001中剂量组患者的平均生存时间较其他剂量组有了很大的提高，研究人员将所得结果与如今广泛使用的吉西他滨治疗法进行比较，显示出GV1001具有更好的治疗效果。2011年11月有关Ⅱ期临床结果表明，对Ⅲ期非小细胞肺癌的情况， GV1001多肽疫苗显示出很好的耐受性，NSCLC患者多数都能产生免疫作用，T 细胞记忆持久^[10-13]。

1.2.多肽药物的分离纯化

多肽药物的分离纯化方法多种多样^[14]，常用的方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法、超滤法。高效液相色谱法在多肽的分离纯化中体现出效果好，时间短，容量大，可回收等特点，人们常用其作为多肽的分离纯化首选方法。此方法可分为以下几种方法。

1.2.1.离子交换色谱法

离子交换色谱法是80快速年代发展起来的一种分离方法，一般利用离子交换树脂作为固定相，固定相上有固定离子基团和可交换的离子基团，当流动相流过交换柱，其中所携带的的组分离子和固定相上可交换的离子基团进行可逆交换，随后可以达到交换平衡。根据不同组分离子对固定离子基团存在差别而达到分离的目的。离子交换色谱常用离子交换树脂作为其固定相，有机溶剂作为缓冲溶液，此色谱法可在中性条件下通过带电性的不同进行多肽的分离纯化。刘璇等利用凝胶过滤层析Sephadex G-75，强阳离子交换色谱SP-650M，提纯出一种活性多肽，这种多肽存在于苦瓜中。 ^[15]；皮钰珍等分别采用DEAE52柱与Q-Sepharose Fast Flow柱作为离子交换色谱的离子交换柱分离纯化鹿胎盘多肽，对比得出DEAE52柱流速缓慢，填料再生处理繁琐，在再生的时候胶的损失过大，通过多方面对比得出Q-Sepharose Fast Flow柱更适合鹿胎盘多肽的提纯^[16]。从多次的实验得出，不同的多肽需要采用的不用的离子交换剂，因此环境条件及洗脱条件的确定对多肽的分离纯化起到决定性的作用，一旦条件选取不当，会导致分离效果大大下降。需研究者寻找最适离子交换剂和最佳操作条件来提高分离效果，故此方法操作较为繁琐。

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