论文总字数：22004字

摘 要

Glarea Lozoyensis是一种海洋丝状真菌。纽莫康定B₀是首个被报道的棘白菌素类化合物卡泊芬净的前体，能够特异性地作用于真菌细胞壁，引起真菌细胞壁的裂解以及细胞内外渗透压的改变从而将真菌细胞彻底杀死,能有一个很好的抗菌效果，而且对身体健康几乎没有影响。G.lozoyensis是纽莫康定B₀的生产菌株。遗传转化体系构建的目的是能够为后续的基因改造优化奠定良好的基础，但现在面临的问题是G.lozoyensis没有稳定的附加质粒，因此在做遗传转化前的首要任务就是构建表达载体。本研究首先利用抗性筛选实验，研究氯霉素、卡那霉素、氨苄霉素、博来霉素、G418和两性霉素六种抗生素对G.lozoyensis生长代谢的影响，选用浓度为25μL/mL博来霉素为抗性筛选标记。其次以获得的G. lozoyensis的18SrDNA保守序列作为同源臂，构建含有外源博来霉素抗性基因ble的同源重组质粒pGB-18Sup-18Sdown。最后通过电转化法将抗性基因导入G. lozoyensis并整合到染色体上。

关键词：纽莫康定B₀ 同源重组 抗性筛选 电转化

A Preliminary Study On The Building Genetic Transformation System Of Glarea Lozoyensis

Abstract

Glarea Lozoyensis is a kind of marine filamentous fungus. Pncumocandin B₀ is a precusor of antifungal echinocandins caspofungin. It is able to function in the cell walls of fungus specifically. It can cause cracking fungal cell and changing the cells osmotic pressure in the inside and outside. Because of these, it will kill fungal cells thoroughly. It has haven good antibacterial effect. It will not affect human health. G.lozoyensis is production strains of Pncumocandin B_0. The structure of the genetic transformation established a good foundation for the improvement of the genetic transformation system. But we have a problem that G.lozoyensis have no additional stable plasmid, so the first priorityis is to construct the expression vector before taking a genetic transformation. Firstly，we study chloramphenicol，ampicillin，kanamycin，Zeocin，G418 and Amphotericin B to the impact on the growth metabolism with resistance screening experiment. Then we select zeocin as G.lozoyensis genetic transformation system of resistance selection markers. We optimized the use of zeocin concentration and adjusted to 25μL/mL.The obtained 18SrDNA conservative sequence of G.lozoyensis treat as homologous arms to structure homologous recombinant plasmind pGB-18Sup-18Sdown containing exogenous zeocin resistance gene. Finally, we used electric transformation method to import the resistance genes into G.lozoyensis.

KeyWords:Pncumocandin B₀;homologous recombination;resistance screening;electric

transformation

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1. 1 棘白菌素类抗生素纽莫康定B₀简介 1

1.2 纽莫康定的结构与合成机制 1

1.2.1 纽莫康定结构多样性 1

1.2.2 纽莫康定的研究发展 2

1.3 丝状真菌的转化方法 3

1.3.1 PEG介导的遗传转化法（PEG-mediated transformation，PMT） 3

1.3.2 电击转化法 3

1.3.3 醋酸锂 (Lithium Acetate) 转化法 3

1.3.4 限制性内切酶介导转化法(RestrictionEn-zymeMediatedIntegration, REMI)

3

1.3.5 农杆菌介导转化法(ATMT) 4

1.4 本课题研究的意义和内容 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验药品 5

2.2 实验仪器 6

2.3 质粒、菌株及引物 7

2.4 培养基 8

2.5 实验方法 8

2.5.1 聚合酶链式反应（PCR） 8

2.5.2 琼脂糖凝胶电泳 9

2.5.3 质粒提取与胶回收 10

2.5.4 载体连接和DNA片段连接 10

2.5.5 化学感受态细胞DH5α转化 11

2.5.6 双酶切 11

2.5.7 外源DNA的制备 12

2.5.8 抗生素筛选 13

2.5.9 转化前预处理 13

2.5.10 电转化 14

第三章 实验结果与讨论 15

3.1 抗生素的筛选 15

3.2 中间质粒pGB的构建 15

3.2.1 pGAPZ a A质粒博来霉素抗性基因ble的扩增纯化结果及与T-Vector连接结果 16

3.2.2 pBlueScript II SK质粒的扩增及与T-Vector连接结果 16

3.2.3 中间质粒pGB的构建 17

3.3 同源重组载体pGB-18S的构建 18

3.3.1 同源臂18SrDNA的构建结果 19

3.3.2 重组质粒pGB-18Sup的构建结果 19

3.3.3 表达载体pGB-18Sup-18Sdown的构建结果 20

3.4 电转化 21

参考文献 23

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1 棘白菌素类抗生素纽莫康定B₀简介

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