论文总字数：20330字

摘 要

几丁质是一种自然界含量丰富的多聚物生物质资源，其降解物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，具有极高的利用价值。生物酶法生产GlcNAc，具有绿色友好、能耗低和产物单一等化学法和物理法不具备的优势。本研究主要是对一株产几丁质酶菌株经行鉴定，发酵产酶条件优化及其酶学性质进行研究。结果显示该菌株为G^-。16S rDNA分析该菌株与Serratia proteamaculans最为相似，因此将其命名为Serratia proteamaculans NJ303。之后对该菌株的发酵培养基碳源、氮源及发酵温度、初始pH进行优化，结果显示该菌株所产几丁质酶最适温度为45℃，最适pH为7.0，Ca² 对酶活有明显的促进作用，而Fe² 、Co² 、Cu² 抑制几丁质酶酶活。对该结果在7.5 L发酵罐中进行发酵验证，当发酵36 h时，酶活可达到1.35 U/mL。最后使用高效液相色谱和质谱对几丁质酶降解几丁质的产物进行分析，结果发现其降解产物十分单一，仅有GlcNAc生成。

关键词：几丁质 几丁质酶 发酵优化 酶学性质 N-乙酰氨基葡萄糖

Identification of a Chitinase Producing Strain, Optimization of Its Fermentation Conditions and Study on Its Enzymatic Properties

Abstract

Chitin is one kind of rich polymer biomass in nature. As its main hydrolyzed products, N-acetyl-d-glucosamine（GlcNAc） has a very high medical application value. The method of enzymatic degradation has more advantages such as small pollution, low energy consumption and product single compared with chemical methods or physical methods. In this study, a high chitinase-producing bacterium isolated. According to characteristics and 16S rDNA analysis, it named Serratia proteamaculans NJ303. After optimized medium and optimum culture, the chitinase activity condition was increased 1.35 U/mL at 7.5 L fermenter. Enzymatic properties were studied, and its optimum temperature is 45℃, The chitinase activity with a wider range pH from 5.0 to 9.0 and the optimum pH of 7.0. Ca2 has evidently promoting action on chitinase, while Fe2 , Co2 and Cu2 have different inhibition degrees. Finally, the results of high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) identification of hydrolysis products of chitin showed that was solely GlcNAc.

Key Words: Chitin; chitinase; Fermentation; optimization; Characterization; GlcNAc

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 引言 1

1.1几丁质简介 1

1.2 几丁质酶 1

1.2.1 几丁质酶简介 2

1.2.2 几丁质酶分类 2

1.2.3 几丁质酶特点 3

1.3 几丁质降解产物研究进展 4

1.3.1 降解产物的应用价值 4

1.3.2几丁质降解方法研究进展 4

第二章 材料和方法 6

2.1材料 6

2.1.1 菌株来源 6

2.1.2仪器 6

2.1.3 实验试剂 6

2.1.4 培养基 7

2.2 方法 7

2.2.1 胶体几丁质的制备 8

2.2.2 DNS试剂配制 8

2.2.3 菌株鉴定 8

2.2.4 发酵条件优化方法 9

2.2.5 酶学性质的研究 10

2.2.6 酶活的测定方法 10

2.2.7 S. proteamaculans NJ303几丁质酶降解产物的鉴定 12

第三章 结果与讨论 13

3.1 菌株鉴定 13

3.1.1 菌株的形态观察 13

3.1.2 菌株分子测序鉴定的结果 13

3.2 菌株S. proteamaculans NJ303液体发酵条件优化结果 14

3.2.1 碳源对S. proteamaculans NJ303发酵产酶影响 15

3.2.2 氮源对产酶影响 15

3.2.3不同初始pH对S. proteamaculans NJ303发酵产酶的影响 16

3.2.4 不同发酵温度对菌株S. proteamaculans NJ303产酶影响 17

3.2.5 S. proteamaculans NJ303发酵罐产酶实验 17

3.3 酶学性质研究 18

3.3.1 温度对几丁质酶酶活影响 18

3.3.2 pH对酶活影响 19

3.3.3 金属离子对酶活的影响 20

3.4 S. proteamaculans NJ303几丁质酶降解产物鉴定 20

3.4.1高效液相色谱法鉴定 20

3.4.2 水解产物的质谱鉴定 21

展 望 22

参考文献： 23

致 谢 26

第一章 引言

1.1几丁质简介

几丁质（chitin），又名甲壳素，是N-乙酰-D-氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc）通过β-1,4-糖苷键聚合得到的一类来源丰富的不溶性多糖，其结构如图1-1。其含量在全球仅次于纤维素排名第二，有数据显示全球几丁质年产量为10¹⁰〜10¹¹吨^[1]。几丁质是一种难溶的多聚物，乃致这么久以来它和它的降解物使用率极低，其实它相对纤维素具有更高的应用价值，尤其是药用价值。直到现在，它的理化特性和生物活性等才逐渐被人们所认识，并广泛运用于保健品、化妆品、环境保护、化学工业等方面，在药用和食品方面尤为突出。此外，目前发现通过降解几丁质获得到的几丁寡糖、几丁二糖或GlcNAc在生物药用方面同样具有重大意义。几丁质普遍存在，在动物、植物等生物中都可以发现它的踪迹，尤其是甲壳纲动物和虾蟹的外壳中含量丰富占有很高的比例^[2]。然而，每年大约有6×10⁶-8×10⁶吨的蟹虾壳被丢弃，由于在自然环境中分解缓慢，大部分都只能随意堆着，不仅造成资源的浪费、占用空间，同时还造成环境污染^[3]。

图1-1几丁质分子结构式

1.2 几丁质酶

1.2.1 几丁质酶简介

几丁质酶（chitinase, E.C.3.2.1.14）是一类能专一催化水解几丁质，释放N-乙酰氨基葡萄糖的酶^[4]。它广泛存在于自然界中，目前已经在多种生物体中被检测到几丁质酶的存在。继几丁质被发现的94年后，1905年拜内克第一次发现了一种能够以几丁质为营养物质的芽孢杆菌；二十年后，Folpmer et al.发现一株放线菌能够在几丁质固体培养基上生长，并发现在菌落周围的几丁质颗粒消失，形成可见透明轮廓。1950年，Jeuniauxl et al.在蜗牛的肠道中成功提取到能降解几丁质的微生物^[5]。此后，关于几丁质酶的研究也越来越多，从其它动植物、微生物中陆续提取出得到了几丁质酶。届时，1984年的国际酶学命名会议上也进行了几丁质酶的系统命名。

1.2.2 几丁质酶分类

几丁质酶在地球上的种类繁多并且分布广泛，根据所来源经行分类，可分为动物型、植物型、微生物型^[6]。许多生物能够分泌几丁质酶，不同的生物产生的几丁质酶所发挥的作用不全相同。当一些病毒或者细菌侵入动物或者植物中时，会通过一定的生化机理诱导动物和植物分泌产生几丁质酶，然后杀死入侵者，达到保护自己的效果^[7]。而在昆虫形成和生长过程中，机体会分泌几丁质酶来促进它们蜕皮过程，来使得躯体生长。对于一些微生物来说，生物体机能相对与高等动植物简单，它们分泌几丁质酶是为了降解一些生物质聚合物形成单体，然后吸收其进行各种生理生化活动^[8]；真菌的细胞壁中也是有几丁质存在的，在整个菌丝生长延伸过程中都会用到几丁质酶。目前，随着几丁质酶来源越来越广泛、基因工程技术的快速发展以及几丁质酶产物功能的挖掘使得几丁质酶已成为研究热门。

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