论文总字数：22636字

摘 要

2-苯乙醇(又称β-苯乙醇)它被大量的用在医药、食品、化妆品、烟草等行业之中。由于原料多来自植物精油，其萃取成本花费过高的原因很难稳定提供给市场量多、质优且天然的产品，因此采用生物转化法生产2-PE（2-苯乙醇）已成为被关注的热点。近年来，以L-苯丙氨酸为前体底物，再利用一些微生物，如酵母细胞，将底物转化为2-苯乙醇，变成了主流。

文章主要对生物转化法生产苯乙醇进行研究。即取花丛泥土培养，通过此菌种对于苯乙醇的抗性，从而实现筛取能够生产苯乙醇的菌种（经检验为热带假丝酵母）。之后对该菌种的的生长环境如：培养基葡萄糖浓度（分别为40g/L、60g/L、 8og/L、100g/L ）、培养温度(25℃、30℃、35℃、37℃)、底物浓度（3g/L、5g/L、8g/L、 1og/L、12g/L ）做梯度实验和分批补料实验，以此进行发酵条件优化。经实验确定在为最优条件35℃、葡萄糖80g/L、底物浓度10g/L，此时产量为2.06/L。

关键词：生物转化法 2-苯乙醇 热带假丝酵母

Screening of Producing 2-Phenylethanol Strains and Optimization of Fermentation Conditions

Abstract

2-Phenylethanol (also known as β-phenylethyl alcohol) is widely used in medicine, food, cosmetics, tobacco and daily chemical products. Due to raw costs of material sources and extraction and other reasons, it is difficult to meet the market demand, and bio-transformation production of natural 2-PE has become a research hotspot. Therefore, L-phenylalanine produced by fermentation or enzymatic method is used as a precursor, which is converted into 2-phenylethanol by using yeast cells, and has become the main trend.

The project mainly focuses on the biotransformation process producing 2-Phenylethanol. That is to say, soil nearby flowers will be collected and according to strain has a resistance to 2-Phenylethanol so that the bacterium that can produce 2-Phenylethanol can be selected from others (tested as Candida tropicalis) . After that, the reacting environment of the strain was as follows: glucose concentration (40g/L, 60g/L, 8g/L, 100g/L, respectively), temperature (25°C, 30°C, 35°C, 37°C). Substrate concentrations (3 g/L, 5 g/L, 8 g/L, 1 log/L, 12 g/L) were used for gradient experiments and fed batch experiments to optimize fermentation conditions. It was determined by experiments that the optimum conditions were 35°C, glucose concentration 80g/L, substrate concentration 10g/L, producing 2.06g/L.

Keywords: Biotransformation;2-Phenylethanol;Candida tropicalis

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 2-苯乙醇研究目的及概述 1

1.2 2-苯乙醇的现有合成方法 2

1.2.1 生物合成方法 2

1.2.2 化学合成方法 3

1.2.3实验室内培养产2-苯乙醇菌株现有方法 6

1.4 课题研究的内容及意义 8

第二章 实验部分 9

2.1 仪器与试剂 9

2.1.1 仪器 10

2.1.2 试剂 11

2.2 筛菌 11

2.2.1 培养基 11

2.2.2 实验操作 12

2.2.3 结果与分析 13

2.3 菌株的发酵培养 15

2.3.1 菌株的耐受性 15

2.3.2 菌株的的单批发酵 16

2.4 发酵条件优化 18

2.4.1 最适温度 18

2.4.2 最适葡萄糖浓度 20

2.4.3 最适底物浓度 22

2.4.4分批发酵 23

2.4.5 发酵罐 26

第三章 总结 30

参考文献 31

致 谢 34

第一章 文献综述

1.1 研究背景及目的

1. 苯乙醇（也称为β-苯乙醇）是一种花香型芳香醇，分子式为C₆H₅CH₂CH₂OH，它被大量的用在医药、食品、化妆品、烟草等行业之中。在常温条件下，它是无色的液体，密度是1.0235，熔点为-27℃，沸点在219°C和221°C之间，也略溶于水以及乙醇、甘油等有机溶液中。除此之外，对碱和空气氧非常稳定。

2-苯乙醇分子结构式

近年来，市场上对于天然香料需求总体上是日益增加的^[1-2]，其实2-苯乙醇出现在许多常见的花卉和植物的精油中。在大多数情况下，其浓度太低是不适合直接萃取的，然而有一个例外---玫瑰油，但其产率多半取决于花的品种，有的可以萃取出高达60％的2-苯乙醇。高百分比只能通过溶剂萃取得到，因为蒸汽蒸馏时的损失很高^[3-4]。由于原料多来自植物精油，其萃取成本花费过高的原因很难稳定提供给市场量多、质优且天然的产品，因此采用生物转化法生产2-PE（2-苯乙醇）已成为被关注的热点，推动了生物技术方法的应用，也使得此方法得到了发展^[5-6]。现在被熟知的生物转化法主要是发酵法或酶法，这两种方法是以L-苯丙氨酸为前体，通过酵母将其转为具有很强自然属性的2-苯乙醇，与从玫瑰花和其它植物精油萃取得到的2-苯乙醇基本相似。除此之外，生物转化法更是避免了化学方法（即苯-环氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氢）的缺点，以氧化苯乙烯加氢法生产所的产品为当今市场的60%，剩下的则被苯-环氧乙烷所占。虽然如今工业生产以化学合成居多，但不得不提出的是其使用的原料大部分具有致癌性，对于生活环境和人们的健康都有一定程度的伤害。因此，微生物转化方法符合现代绿色化工的发展趋势，有更光明的开发前景和更大的工业规模生产的空间^[7-8]。

目前市场上最新的2-PE市场数据是从1990年开始计算的。1990时，世界年产量大概为7000吨，其中6000吨芳烃，合成酯类产物用去990吨，其余10吨主要是在香味应用上。至于产品的价格，很有必要将不同的分类区别开来。2-苯乙醇目前的的价格约为3.50美元/千克，而标有“天然”的相同材料价格约为每千克1,000美元（personal communication,Paul Kaders,Hamburg，Germany），价格差别的原因在于不同的生产方法。在美国和欧洲，所谓的“天然”芳香剂和香料必须是物理的（植物提取物）、酶或微生物方法来生产所得( US Food and Drug Administration2001）)。昂贵的天然物质与廉价的掺杂石化产品的产品可以被检测出来，例如由2H核磁共振光谱所确定的特定于位点的氘分布来检测。国内对于采用生物转化法生产2-苯乙醇的研究相较于国外较晚，但迄今为止已取得了许多研究成果。例如使用非分批补料的方式来转化2-苯乙醇，而我国取得了至今最好的数据（即培养浓度最高时4.82g/L）^[9]。

1.2 现有方法

1.2.1生物转化法

微生物体积小，转化合成产物快，传播速度快，对环境适应能力强。生物转化法合成2-苯乙醇不仅在很大程度上保留了产品的天然，而且生产成本低，效率高，所需时间短，产品收率高。研究表明，酵母显然是最主要的生产天然2-PE的微生物，但在很大程度上依赖于养分，特别是氮源。例如，在葡萄汁中培养的7天内， 蔗糖酵母菌和Torulopsis utilis在葡萄汁中分别产生了12mg / l的2-PE^[10]，不同的Kluyveromyces marxianus株在5天内可产生72 mg/ l^[11]或400 mg/ l^[12]，产量根据培养基成分的不同而不同。

并且酵母不同于其他细菌，其既能够从分解代谢途径直接把L-苯丙氨酸转化合成2-苯乙醇，也能从最初合成2-苯乙醇。由于天然的高浓度的2-PE在玫瑰花中是存在的，显然应该研究培养玫瑰叶芽的植物细胞。Rosa damascena的培养最终只产生了少量的2 -苯乙醇(0.013 mg/ kg)，此外这一整个培养的周期需要几个星期甚至更多时间^[13]，这是植物细胞培养对其潜在工业用途的典型缺陷。关于细菌是否合成2 -苯乙醇的信息很少见，但微生物的sp1和短杆菌亚麻布具有这种能力^[14]。

在真菌中，也存在很多生产芳香族的菌种。例如Phellinus ignarius，P.laevigatus和P. tremulae^[15]能够生产2-PE以及Ischnoderma benzoinum^[16]和Geotrichum penicillatum^[17]。 但是产量就相对而言较低，例如安茴二酸在20天内的产量为280毫克/升，但在99小时内仅为0.0142毫克/升。但是如果生长培养基中补充前提下，则可以获得更高的产量。例如，Kluyveromyces marxianus CMICC 298302在9天时间内利用6g / l L-苯丙氨酸中产出了1,375mg的2-苯乙醇^[18]。

（1）Ehrlich途径

大部分的微生物，特别是酵母都是能以正常的代谢途径从头合成2-苯乙醇，但是所选菌株的培养液中2-苯乙醇的终浓度通常仍然很低；如果将前体物质L-苯丙氨酸添加到培养基中，则2-苯乙醇的收率可以大大增加。条路线早在1907年就由Ehrlich发现，也因此命名为Ehrlich途径^[19]。：首先通过细胞中的氨基转移酶的作用将L-苯丙氨酸转化成苯丙酮酸，然后通过丙酮酸脱羧酶的催化裂解使其脱羧成苯乙醛，后在醇脱氢酶的作用下生成最终产物2-苯乙醇。当Ehrlich研究这一途径时，他得出结论：菌体培养基中L-苯丙氨酸的的浓度对最终的2-苯乙醇的产量有很大的影响。目前为止，Ehrlich方法是以生物法合成生产2-苯乙醇的最重要的方法^[20]。见图1.1。

图1.1 Ehrlich途径

（2）苯丙酮酸途径

生物体内主要有两种可合成得到2-苯乙醇：一，通过莽草酸途径即由莽草酸生成芳香氨基酸和其他多种芳香族化合物从头合成。二，以L-苯丙氨酸为前体底物，分别由糖酵解和戊糖磷酸途径产生的赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸被浓缩，分支酸和预苯酸作为中间产物使苯丙酮酸酿酒酵母中苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸进行生物合成，得到最终产物^[21]。代谢途径见图1.2。

对于微生物特别是酵母而言，L-苯丙氨酸存在几种的生物讲解方法，降解是通过苯丙氨酸氨裂解酶除去氨基以产生反式肉桂酸酯，其中肉桂酸酯途径较为常见，以玫瑰孢子菌和粘红酵母为例^[22]。对于使用这些氨基酸作为氮源的酵母，不需要进一步的降解。那些可以使用这些氨基酸作为唯一的碳源的酵母可进一步打破他们经原儿茶酸转化为3-酮己二酸，最后进入三羧酸（TCA）循环。培养集中的主要氮源物质基本上确定了细胞使用的路径，只有在氨基酸作为主要氮源时，Ehrlich占较主要地位。但是，如果在培养集中存在更易被细胞吸收的氮源，氨基酸将通过肉桂酸酯途径代谢。即使在高浓度的L-苯丙氨酸环境下，肉桂酸酯途径不曾被完全抑制。氨基酸含量低，总是降解，导致完全的L-苯丙氨酸向2-苯乙醇的转化不能够被完成。代谢过程见图1.2^[23]。

图1.2

1.2.2 化学转化法

自从在玫瑰花和其他植物精油中得到了2-苯乙醇后，人们便开始研究实现化学合成方法工业化的方法。如今，实现工业规模化学合成的方法很多，但主要还是以苯、甲苯以及苯乙烯为主作原料进行合成，主要合成路线如下。^[24-25]

(1)以苯为原料的合成方法

方法1：

苯和环氧乙烷在无水三氯化铝的作用下反应合成2-苯乙醇化物，2-苯乙醇水解后，该方法是制备2-苯乙醇的主要方法。缺点：随着产品的合成会有较多的副产品,如联二苯、氯代乙苯及氯乙醇，伴有难闻气味，且沸点与2-苯乙醇的沸点相似,难以用分馏法去除，因此必须采用化学方法去除，过程较为复杂。优点：生产工艺步骤较少，设备要求低。

方法2：

将醋酸乙烯醋或其他的乙烯化合物在浓硫酸的条件下与苯作用,生成乙酸苯乙醋,而后水解就可得到2-苯乙醇。优点：本途径使用的原料易获得,价格低廉。

1. 以甲苯为原料的合成方法

方法一：

氯化甲苯通氯气的情况下反应，进行侧链取代生成氯化苯,与氰化钾取代反应得氰化苯,而后通氢气将其还原成苯乙胺,在碱性环境下反应得到所需产物。此工艺在制造过程中使用了剧毒的氰化钾,因此有工艺也比较复杂的缺点,因此不适合大规模的生产,可用于小规模的制备。

方法2：

第一步用氯发生取代反映取代甲苯侧链生成氯代甲苯，第二步经氰化生成的氯化苯转化为氰化物苯，第三步中间产物水解生成苯乙酸，第四步乙醇乙酸生成乙酸乙酯，第五步加入Na和乙醇进行还原，最终也可得到产物2-苯乙醇。

1. 以苯乙烯为原料的合成方法

方法1：

把苯乙烯的侧链乙烯氧化成为乙烷,将苯乙烷催化加氢就直接能够得到产物2-苯乙醇。这个方法在世界上处于领先地位,也是现今市场上生产2-苯乙醇的最重要的方法。

方法2：

在适宜的的反应条件下,盐酸与苯乙烯加成生成氯化苯乙烷,后在弱碱性条件下经碳酸氢钠催化水解得到2-苯乙醇,此方法产物得率很高。

方法3：

加成苯乙烯和次氯酸得氯代苯乙醇，将中间体在高浓度氢氧化钠溶液中发生皂化得到环氧苯乙烷，催化氢化还原环氧苯乙烷的最终产物。

今天，化学合成2-苯乙醇的方法是以氧化苯乙烯加氢法以及苯-环氧乙烷法为主。实际上。使用后者合成生产的产品是不能被于生产香料或芳香制剂的，因为它含有一些杂质，这些杂志都具有不同的气味会导致很大的香味差异。：国内生产2-苯乙醇仍主要是氧化苯乙烯加氢的方法，苯-环氧乙烷合成法所得产品难以国家规定。

1.3 基本方法

工业生产中决定生产水平主要取决于生产菌种、发酵工艺和提取分离工艺这三个，其中菌种为主控因素^[26]。有的菌种被分离后可直接使用，有的则需进行人工诱导得到产量更大或是更可控的菌种后才被投入使用。实际上，现在存在很多能把L-苯丙氨酸转化合成2-苯乙醇的微生物但是产量都过低，只有酵母菌能够以较高的浓度转化^[26]。然而，转化为菌株的2-苯乙醇的浓度，即使是相同菌株的菌株也有很大差异。对于通过微生物转化生产天然2-苯乙醇，那么筛选一种稳定且高产的菌是至关紧要的，也是进一步研究生物转化合成法的重要条件和前提。

1.3.1实验室中有以下几种培养方法

1分批培养转化法

分批培养转化法通常在微生物培养时添加用于转化的底物，大部分在对数生长期中期和后期产生较多酶时投入。也有部分工艺是在微生物培养早期时投加底物，方式可以是一次性或者分批、分次加入。加入底物存在两种方式：其一，直接加入固体粉末；其二，底物的水溶液，对于略溶或是难溶于水的底物，如果需要也可以提前将其溶于有机溶液以备后续投料。^[26-28]

2静息细胞转化法

静息细胞转化法是最大程度上减少生长对于细胞的作用，以此条件下进行生物转化。具体步骤是，首先将细胞培养到所需条件时分离菌体与培养液，随后将其置于不完全培养基中并保持悬浮状态，此时不完全培养基（缓冲液或缺少氮源的培养基）难以提供其生长所需物质使其不能继续生长，但不能死亡，最终投加L-苯丙氨酸并于适宜的条件下培养^[29]。活性干细胞可以使用干燥的丙酮干粉制备物或冷冻干燥制备，可长期保存，待实验时取用。

3转化培养法

转化培养法能够任意的调节菌体浓度，从而提高细菌细胞的利用率，减少营养物质的加入，这简化提取产物示分离纯化的步骤。

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