UGP1基因敲除菌的构建与验证毕业论文
2022-01-28 22:37:24
论文总字数：23746字
摘 要
酿酒酵母作为工业模式微生物，在我们的生产生活中起到至关重要的作用。但在实际生产中，存在高温这一环境胁迫因素，会降低菌种发酵性能，延长发酵周期，对产品产量和质量造成极大影响，因此提高酵母菌的耐热性逐渐成为发酵工业的热点问题。由于酵母菌的耐热性与海藻糖有关，因此本课题以酿酒酵母模式菌BY4741为研究对象，将海藻糖代谢途径中海藻糖合成前体UDP-葡萄糖的合成基因UGP1敲除，这为之后研究UGP1基因敲除对酿酒酵母耐热性的影响提供便利。
关键词：酿酒酵母 UGP1 基因敲除 耐热性
Construction and Verification of UGP1 Gene Knockout Bacteria
ABSTRACT
Saccharomyces cerevisiae, which is an industrial model microorganism, plays a crucial role in our daily life. However, when it is used in production, the high temperature will decrease the fermentation performance, prolong the fermentation cycle, and have a great impact on product yield and quality. Therefore, increasing the heat resistance of yeast has gradually become a hot issue in the fermentation industry. Since the heat-resistance of yeast is related to trehalose , in this study, the strain BY4741, a model strain of Saccharomyces cerevisiae, was used as the research object to knock out the gene UGP1, which controls the synthesis of UDP-glucose,a precursor in the trehalose metabolism pathway. This study will facilitate the study of the relationship between S. cerevisiae and heat resistance.
Key words: Saccharomyces cerevisiae；UGP1；Gene knockout；Heat resistance
目 录
摘 要 I
ABSTRACT II
目 录 III
第一章 文献综述 1
1.1 热胁迫对酵母产生的不利影响 1
1.2 酿酒酵母耐热机制 2
1.3 海藻糖与酿酒酵母的耐热性 3
1.4 海藻糖合成途径 4
1.5 敲除技术 5
1.6 课题研究内容及意义 6
1.6.1 本实验研究的内容 6
1.6.2 研究的意义 6
第二章 材料与方法 8
2.1 实验材料 8
2.1.1 菌株与质粒 8
2.1.2 药品与试剂 8
2.1.3 仪器设备 9
2.2 实验方法 10
2.2.1 实验所用培养基及其成分 10
2.2.2 引物 10
2.2.3 冷冻干燥菌种的恢复培养 12
2.2.4 大肠杆菌电击感受态细胞的制备 12
2.2.5 质粒pUG6和pRS415-prTHI4-UGP1-GFP的转化 13
2.2.6 碱裂解法制备pRS415-prTHI4-UGP1-GFP和pUG6质粒DNA 13
2.2.7 酿酒酵母电击感受态细胞的制备 14
2.2.8 酿酒酵母电击转化 14
2.2.9 菌落PCR验证酵母菌落 15
2.2.10 Q-PCR分析UGP1转录水平变化 15
第三章 结果与讨论 18
3.1 质粒pRS415-prTHI4-UGP1-GFP的提取验证 18
3.2 质粒pRS415-prTHI4-UGP1-GFP的转化与验证 18
3.3 UGP1基因敲除盒的构建 19
3.4 UGP1基因敲除序列组件的转化及筛选 20
3.5 △UGP1菌中UGP1转录水平的测定 21
第四章 结论与展望 23
4.1 结论 23
4.2 展望 23
参考文献 24
致 谢 28
第一章 文献综述
工业微生物是发酵工业的基础和核心，一直以来都是以菌株的选育及改造为研究重点。对于具有实际商业价值的微生物，通常使用基因工程的手段来改变特性，并大大的提升产量和降低生产成本。而在发酵工业中，提高菌种的耐热性是改造微生物的一个热门方向，因为菌株较高的发酵温度可有效地缩短发酵周期，同时可以减少资源的消耗和浪费，并且提高产品产量及质量，进而很大程度上减少成本，创造收益[1,2]。但是，自然界存在的大部分的菌株对温度十分敏感，较高温度的发酵环境常不利于菌株的生长和代谢，甚至会造成菌株失活而死亡，影响产品产量及质量。因此，如何提高发酵菌株的耐热性逐渐成为发酵工业关注的焦点。
酿酒酵母是一类生长周期短，繁殖速度快，培养需求简单的真核生物，且是发酵工业中最普遍且使用最广泛的菌种，因而成为主要的研究对象。酿酒酵母对温度较为敏感，而发酵过程中诸多因素会造成酵母处于高温状态，过高温度会导致其生长速率、细胞活性等降低，不利于菌株的生产发酵，会造成产品的产量和质量受到影响。有研究表明，在40℃下发酵相同时间，耐热菌株的发酵液中酒精的含量要明显高于不耐热菌株，而且，在53℃的致死温度下处理相同的时间（6分钟以内），耐热菌株的存活率高于不耐热菌株[3]。所以，选育出具有热耐受性的酿酒酵母不仅意味着可以在气温较高的季节正常生产，同时还可以减少能耗和污染，简化整个发酵的过程，提高发酵产量。而且，不只是在发酵工业中，良好热耐受性的酵母还可以在食品发酵、饲料生产等领域发挥很好的作用。目前，通过人工选育的手段，已经有不少耐热酿酒酵母投入生产，创造了较高的收益。不过，总的来说，酵母耐热性的提升程度还是比较有限，只有极少数的酿酒酵母可以在超过41℃的条件下生长[4]，而且酿酒酵母具有多种不同的耐热性机制，因此在如何进行精准、有效地选育上也带来了不小的难题。
1.1 热胁迫对酵母产生的不利影响
高温环境会对酿酒酵母的正常生长和代谢造成巨大影响，在温度偏高时，细胞的活力会大幅降低，并且细胞也可能发生畸变，同时细胞内膜系统、细胞骨架和染色体结构也会被高温破坏，从而失去合成蛋白质的能力，导致细胞分裂和生长停止，最后引起细胞大量死亡[5]。
高温也会破坏很多酶类和蛋白质，其中大量与电子传递链有关的蛋白质被破坏以后，会在酿酒酵母细胞内产生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），而ROS主要包括有羟基（•OH）、过氧化氢（H2O2）以及过氧化物的阴离子（•O2-）等[6]。生物体进行有氧呼吸时，细胞内的线粒体通过氧化磷酸化产生ATP，为细胞生长和代谢提供能量，而且线粒体数量的多少将直接决定细胞活动的旺盛与否，决定发酵产物的多少。一旦电子传递链发生电子大量泄露以后，会对线粒体造成不可逆伤害，这将直接影响酵母细胞的正常生长。除了对线粒体造成损害以之外，ROS还可以对生物大分子造成损害，比如在DNA的复制、转录和翻译过程中。一旦这些生物大分子被破坏，细胞的整体生物功能也会受到影响，进而酿酒酵母的正常生长和代谢也被抑制[7]。
1.2 酿酒酵母耐热机制
一般情况下，把能在超过40℃以上的环境下正常生长的酿酒酵母称为耐热酿酒酵母[8]。 酿酒酵母耐热机制并不单一，经过长期的研究，发现酵母耐热性与下列因素有关：应激糖蛋白、热激蛋白（HeatShockProtein,HSP)、ATPase、谷胱甘肽（GSH）及海藻糖等。下面主要对HSP、GSH和海藻糖作简单介绍。
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