论文总字数：15266字

摘 要

苹果酸，又分为L-苹果酸和D-苹果酸以及DL-苹果酸，其中L-苹果酸广泛存在于自然界中，也能通过化学方法合成或微生物发酵法进行发酵生产。它有让人舒适的酸味，且安全性高，被广泛运用于食品添加剂中。由于其化学性质稳定，结构不易变化，在医学用品和保健品中也被少量添加作为稳定剂，在现实生活中运用广泛，在许多国家供不应求。黄曲霉作为生产L-苹果酸较为合适的一种菌类，在近年来被大量用于研究提高L-苹果酸产量的实验中。本次课题研究的就是黄曲霉产L-苹果酸的条件优化，使用不同的碳源、氮源、培养温度以及在培养过程中添加不同浓度的碳酸钙对黄曲霉产L-苹果酸的影响，寻找最优的条件，提高L-苹果酸的生产量。最终确定最适碳源为葡萄糖，氮源为硫酸铵，培养温度使用32℃-28℃的变温培养，最佳碳酸钙浓度为75 g/L,用以上条件产出的L-苹果酸的产量为38.68 g/L。

关键词：黄曲霉；L-苹果酸；条件优化；发酵生产

Optimization of Fermentation of Malic Acid Produced by Aspergillus

Abstract

Malic acid is further divided into L-malic acid, D-malic acid and DL-malic acid.Among them, L-malic acid is widely found in nature and can also be produced by chemical synthesis or microbial fermentation. It has a pleasant sour taste and high safety and is widely used in food additives. Because of its chemical stability and its inflexible structure, it has also been added as a stabilizing agent in medical products and healthcare products. It is widely used in real life and is in short supply in many countries. Aspergillus flavus is a suitable mold for the production of L-malic acid, and has been used in a large number of experiments for increasing the yield of L-malic acid in recent years. This study focused on the optimization of conditions for the production of L-malic acid by A. flavus, the use of different carbon sources, nitrogen sources, incubation temperatures, and the variation of L-malic acid production which caused by different concentrations of calcium carbonate during culture. Finding the best conditions to increase the production of L-malic acid. Finally, the most suitable carbon source is glucose, the nitrogen source is ammonium sulfate, and the culture temperature is varied from 32°C to 28°C. The optimum calcium carbonate concentration is 75 g/L. The above conditions produce L-malic acid. The yield was 38.68 g/L.

Key Words: A. flavus; L-malic acid; condition optimization; fermentation productio

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 苹果酸的基本性质 1

1.2 L-苹果酸的生物合成途径 1

1.3 L-苹果酸的用途 1

1.3.1 食品业 1

1.3.2 生理用途 2

1.3.3 医用及保健品 2

1.4 苹果酸在国外的发展状况 3

1.5 苹果酸在国内的发展状况 3

1.6 L-苹果酸的生产方法 4

1.6.1利用苹果渣发酵生产L-苹果酸 4

1.6.2固定化细胞生产L-苹果酸 4

1.6.3酶转换法生产L-苹果酸 5

1.6.4微生物法发酵生产L-苹果酸 5

1.7黄曲霉的性质 5

1.8对黄曲霉产L-苹果酸的相关研究 6

1.8.1近年发展趋势 6

1.8.2黄曲霉产L-苹果酸的优势与缺点 6

1.8.3提高L-苹果酸产率的手段 7

1.9黄曲霉产L-苹果酸的发展前景 8

第二章 实验材料与方法 10

2.1实验材料 10

2.1.1所用菌种 10

2.1.2培养基 10

2.1.3主要仪器及设备 11

2.1.4主要试剂 11

2.2实验方法 12

2.2.1 流程与方法 12

2.2.2苹果酸的定性检测 12

2.2.2.1三氯化钛法 12

2.2.3 苹果酸的定量检测 12

2.2.3.1 HPLC法 12

2.2.4 PH的测定 12

2.2.5 总糖的测定 13

第三章 实验结果与分析 14

3.1使用不同碳源对L-苹果酸产量的影响 14

3.2使用不同氮源对L-苹果酸产量的影响 14

3.3添加碳酸钙的量对L-苹果酸产量的影响 15

3.4培养温度对L-苹果酸产量的影响 16

3.5 培养条件的优化 16

第四章 结语与展望 18

参考文献 19

致谢 22

第一章 文献综述

1.1 苹果酸的基本性质

苹果酸顾名思义是一种酸类，它从外表上看通常是晶体，有时以白色结晶状的粉末呈现。它的化学名为2-羟基丁二酸，在其分子中，存在一个不对称的碳原子，因此有两种立体异构体。苹果酸可以通过化学方法合成，但同时也在存在于大自然中，通常以D-苹果酸、L-苹果酸还有它们的混合物DL-苹果酸这三种形式存在。L-苹果酸存在于自然界中，且生产方式多种多样，DL-苹果酸可用化学合成法合成，但它的安全性比L-苹果酸低，美国已经禁止DL-苹果酸作为婴儿室食品添加剂^[1]，只用L-苹果酸作为食品添加剂，从市场上来看L-苹果酸供不应求，所以发掘其他的生产途径或是提高其在现有生产方式上的产量，是一项十分具有意义的研究。

1.2 L-苹果酸的生物合成途径

L-苹果酸在生物体内的合成途径有三条^[2]。第一条：葡萄糖首先合成丙酮酸（通过糖酵解途径），然后再由丙酮酸经过柠檬酸循环（即三羧酸循环）合成L-苹果酸。第二条：葡萄糖首先在糖酵解过程中合成丙酮酸，再由丙酮酸经过柠檬酸循环以及乙醛酸同时合成L-苹果酸。第三条路径延伸到二氧化碳的固定：葡萄糖首先在糖酵解过程中合成丙酮酸，此时二氧化碳的固定反应会对四碳酸进行补充。糖酵解中合成的丙酮酸受丙酮酸羧化酶的作用，与外源性二氧化碳结合，反应生成草酰乙酸，再在苹果酸脱氢酶的作用下还原成苹果酸。

1.3 L-苹果酸的用途

1.3.1 食品业

苹果酸有让人舒适的酸味且性质稳定，安全性很高，因此也有了一定的用途^[3]，与柠檬酸一起配合，还能模拟天然果实的酸味，故它在果酱和果冻的加工、作为风味食品的添加剂、在各类罐头糕点和甜点中作为酸味剂被使用等领域的应用十分广泛，还能作为抗菌剂使用。除了苹果酸本身以外，苹果酸的衍生物也有很重要的现实作用。它在食品工业上起到不小的作用，对于香肠或咸肉、咸鱼罐头等食品，苹果酸的衍生物能参与其制作过程，成为组成这些食品中的一员。在面食类食品中也能少量加入它，同时减少盐的含量，可以让面类食品的味道更为柔和，有调味的作用。

1.3.2 生理用途

调查发现，人体内苹果酸的含量在人经过不间断运动的5分钟后开始明显上升^[4]，在这过程中，人体内苹果酸浓度变化的幅度很高，比其他柠檬酸循环的中间物浓度的升高幅度更明显^[5]。苹果酸能参与人体代谢，非内源性苹果酸能被身体快速吸收并且利用，进入人体的循环之中。它能渗透细胞膜进入线粒体，为人体在某些条件下的机体需求提供能量。经过研究发现，在给小鼠注射复合苹果酸营养液之后，小鼠的负重游泳力竭时间明显增强^[6]。因此，服用苹果酸还能够降低亚极量定量负荷运动之后人体内血乳酸的浓度，提高人体的有氧做功能力^[7]。且动物体的实验发现，当机体的ATP需求上升时，肝脏线粒体内苹果酸的浓度水平会增加，线粒体内底物合成ATP的作用也随之增加，因此可以小小地推测，苹果酸能推动动物体线粒体产生ATP^[8]。

1.3.3 医用及保健品

苹果酸在一定程度上能保护心脏，现临床上已经将苹果酸加入基础心脏液中，混合含钾和镁离子的元素一起保护心脏的能量代谢。将苹果酸加入到药物制剂、片剂和糖浆中，或者配置到氨基酸溶液中，能明显提高服药的人对氨基酸的吸收率，且能增加药物的稳定性。它广泛应用于各种疾病的治疗中，如尿毒症、高血压、肝病、免疫力低下。据研究，它的衍生物苹果酸钠还能减轻抗癌药物对人体的毒副作用。对于肾脏以及骨髓的细胞，苹果酸钠有保护其的作用，并且若在抗癌药物中加入了少量的苹果酸钠，服用之后能显著降低其在较没加苹果酸钠之前对人体产生的毒性^[9]，但是不影响抗癌药物在人体内的作用活性，因此有助于减少癌症患者由于化疗而对人体带来的副作用。苹果酸钠由于含有食盐三分之一的盐味，除了在食品工业上用于加入咸肉中增加风味，还能作为肾病病人的食盐替代和补充其缺乏的铁、锌和镁等药物。苹果酸钾是这类补充药物的不二人选，它不仅能达到上述的功效，还能保持服用者身体里的水分平衡，治疗高血压、水肿和脂肪聚积症等^[10]。

现在保健品中也有苹果酸的身影，它有降低PH的作用，用途广泛，因此需要大规模生产应用。

1.4 苹果酸在国外的发展状况

L-苹果酸是国外用量非常大的一种甜味剂，因为它广泛存在于水果蔬菜中。由于其被登记确认为是一种绝对安全无害且可食用的有机酸（美国食品药品监督局），故其在国外有很广阔的销售市场。国外有一些在生产苹果酸的领域独占鳌头的企业，比较具有代表性的就是美国的ALLied chem公司（产苹果酸7000 t/a）以及日本扶桑化学公司（产苹果酸1.2万t/a），这两家公司所生产的苹果酸并不用于内销，而是主要用于出口。日本还有很多大型公司也在生产苹果酸，日本是苹果酸最主要的生产国和输出国^[11]，它们国家产出的苹果酸的量占全世界产量的50%甚至更多。在日本有三家公司在生产苹果酸的领域分庭抗礼，分别是扶桑化学、三菱化成和协和发酵。这几家公司的苹果酸产量在全日本苹果酸总产量中占了非常大的比重，可以被称为日本生产苹果酸的三巨头。近年来西欧和英国等地的国家，对苹果酸生产和研发的领域也在进行毫不间断的探索，加拿大更是在发展中有了飞跃性的提升。

1.5 苹果酸在国内的发展状况

现L-苹果酸的生产方式有如下几种^[12]，如以石化产品为原料发酵、以蜜糖为原料发酵、以富马酸原汁发酵，还有化学合成法、一步发酵法、两步发酵法、酶转换法和直接提纯法，还有的工艺会用到固定化细胞和固定化酶法联产L-苹果酸和天冬氨酸。随着我国经济的不断发展，L-苹果酸的需求量日益增大^[13]，。改革开放时期，上海、广州等地曾进行苹果酸的相关生产工作。然而受制于20世纪80年代的生产条件，其产品仅为试剂和生化级别。1985年10月，津福化工厂建成了年产量100 t的车间。该工厂位于河北黄骅，两年后研发了苹果酸生产新技术，并将该技术转让给相关工厂以促进民族企业发展。该新技术基于固定化细胞，所生产的产品水平达到出口标准，并可进行连续生产。苹果酸酸味剂的需求量，曾于1990年前后猛增，此后进入平稳增长期。截至目前，国内需求量已经增长为10 kt每年。我国年产量500 t以上的厂家仅为四家。其中，年产量最大的为南国生化场，该厂家从属深圳南头新元实业有限公司，年产量2000 t。可见，目前市场供需关系依然不平衡，具有较大的供给缺口，因此应着重发展L-苹果酸生产技术以提高其生产率。

1.6 L-苹果酸的生产方法

1.6.1利用苹果渣发酵生产L-苹果酸

我国工业里生产L-苹果酸的最普遍的方法，就是用苹果渣作为原料，发酵生产L-苹果酸。因为苹果渣里L-苹果酸含量很高，且富含优良的食用级别纤维素，工业化生产中大多用富马酸、反丁烯二酸合成利用L-苹果酸。此方法在工业生产中被广泛利用，因为由此产出的L-苹果酸纯度很高，副产品利用率好。但此法的缺点是生产成本太高，无法大批量进行生产，产量质量差，无法长期保持这种生产模式^[14]。所以这种生产方式让我国无法成为L-苹果酸的出口大国，而是需要依赖向他国进口。

1.6.2固定化细胞生产L-苹果酸

固定化生产L-苹果酸^[15]。将游离的微生物，用化学方法或者物理手段，把它的定位限制于特定的区域或者空间内，这就是固定化微生物技术。在这项技术中，由于游离的微生物不能活动扩散，而是被限定活动范围，故能在一定范围内将微生物的细胞浓度进行提高，且不影响其的生物活性，还能将其进行反复利用。制备固定化霉，所使用的方法是海藻酸钠包埋法。选择最优的试剂浓度，将制备好的固定化霉进行摇床培养，并用纸层析法进行L-苹果酸的定性测定，但它适合更多批次发酵或连续发酵。

1.6.3酶转换法生产L-苹果酸

酶转化法及微生物发酵法生产L-苹果酸^[16]。是指在生物膜或超滤膜上，用某种手段将酶固定其上，使用这种技术方法的一大优点是可以使底物的转化和产品分离，还有酶制剂的再利用三步合为一体，大大提高了酶的利用效率和工作能力，而后再将载体进行结构的改造，改造之后的微生物由于抑制作用而不会生产琥珀酸等副产物，以此提高转化率。

1.6.4微生物法发酵生产L-苹果酸

微生物法发酵生产L-苹果酸就是利用在土壤或者水中、果实里、空气里或其他易得的地方筛选并且提取培养的菌株，进行放大培养，一步或者二步发酵来利用微生物的代谢来发酵生产L-苹果酸。一步发酵法平时多称为直接发酵法，是直接用糖类物质作为原料，用单一种类的霉菌发酵直接生产苹果酸。二步发酵法也是以糖类物质作为原料，但是使用的菌类或微生物具有不同的生理功能，先产生除了L-苹果酸以外的另一种酸，然后再将另一种酸转换成L-苹果酸的分成两步完成的发酵方法。

1.7黄曲霉的性质

黄曲霉属于半知菌类，主要可见于因受潮霉变的大米、粮食，和其他易于腐烂发霉的有机物中，呈现出腐生型好氧真菌的特性。黄曲霉菌落结构并不致密，常见灰绿色，背面褐色或无色。两类大量且结构复杂的菌丝构成了其菌体。其中，以分隔为显著特征的菌丝是营养菌丝，而部分分型，可产生分生孢子梗的菌丝为气生菌丝。气生菌丝顶端会产生表面一般为双层的烧瓶形或者近球形顶囊，并且常挂表面粗糙的球形分生孢子。孢子头由孢子梗，小梗，顶囊组成，常用于产生蛋白酶、磷酸二酯酶和淀粉酶，与此同时，该菌种也常用于酿造工作之中。

1.8对黄曲霉产L-苹果酸的相关研究

1.8.1近年发展趋势

以蜜糖为原料发酵苹果酸的过程里，可以使用黄曲霉将蜜糖发酵为L-苹果酸，黄曲霉是苹果酸生产的较为理想的宿主^[17]。我国从1982年开始从土壤中采集样品，分离菌株，研究L-苹果酸的发酵^[18]。对于菌种筛选以及诱变等工艺条件的改良及优化，我国近年来在此块以及相关的领域做了大量的研究，摇瓶发酵的产酸率、总酸中苹果酸的含量、转化率分别提高至9%、72%以及60%以上。可用粗放的生产原料甘薯，经过液化之后，利用菌种本身含有的糖化酶，无需经过糖化工序也能直接用于发酵^[19]。最古老的生产方法是直接从果实中提取苹果酸，但因为这种方法产量低，所以已经被淘汰，经过了多年的研究，现在已经得出了许多黄曲霉产L-苹果酸的方法。

1.8.2黄曲霉产L-苹果酸的优势与缺点

黄曲霉是一种工业上常见的菌种，它在纬度16°到35°的温带地区分布得较为广泛，在45°以上的地区极少见。获得黄曲霉可以通过在土壤、灰尘或者果实上取样并进行菌种筛选得到菌株，在核桃、花生、杏仁等粮食里也大量存在。它的生长能力极强，且耐高温，生命力顽强，即使是在干旱的极端条件下也能生长，生成菌落的速度也非常快。传统合成L-苹果酸的方法是化学合成法，合成的产品是DL型苹果酸，它所用的原料一般是石油，成本不高，甚至可以算得上是低廉，但是它合成的产品具有较大的毒性且不容易被吸收，所以此种方法生产出来的L-苹果酸不能投入到食品或者医用领域中使用，局限性很高，可用性很小。现在工业上多用酶转换法L-苹果酸，所用的原材料基本都是富马酸，依靠富马酸酶转化来生产L-苹果酸，产量的多少依赖于原材料富马酸的纯度高不高，转化率高不高，这样才能大批量生产L-苹果酸。但是高纯度化学合成的富马酸成本又很高，而购买这种纯度的富马酸价格很高，自己生产这种纯度的富马酸则会对周围的环境污染较大，且后处理步骤复杂，产品中含的杂质较多，副产品比如除了富马酸以外的其他酸种类多难以提纯分离等缺点，虽然它克服了传统合成L-苹果酸所用的化学合成法高度依赖石油原料的缺点，但是它还是需要向国外引进原料和产品才能满足我国现阶段对L-苹果酸的需求。利用黄曲霉生产L-苹果酸属于微生物发酵法生产L-苹果酸，现在此法已经受到世界上许多工厂的重视，因为此法的原料微生物廉价易得，仅仅只是酶转换法生产L-苹果酸的大约四分之一。原料分布广且出处十分丰富，所生产出来的副产物少，杂质酸的种类也少，约为酶法的五分之一，生产出来的L-苹果酸具有食用安全性高、纯度高、质量高等优点，且也不需要使用成本昂贵的技术或者方法，将传统的发酵与优质的菌种筛选纯化级放大相结合，技术稳定性高且可行性很强。对比以上此法，该法更加适合投入到大批量工业化生产L-苹果酸之中去，具有很广阔的发展市场和非常良好的前景。

1.8.3提高L-苹果酸产率的手段

影响L-苹果酸产率的条件有很多，发酵中最基本的温度、PH等都能影响L-苹果酸的产率，除此之外，在培养基中添加不同浓度的碳酸钙作为调控PH的添加物、还能提供二氧化碳进行碳的固定，也能对L-苹果酸的产量产生影响。在这些常规的控制条件中，将糖质原料的浓度加大到一定的浓度可以显著提高L-苹果酸的产率^[20]。提高原浓度的10%，L-苹果酸产率最高，但高于12%之后L-苹果酸的产率降低。改变氮源也能影响L-苹果酸的产率^[21]。除此之外，还有形形色色的方法可以用于提高苹果酸的产率。

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