论文总字数：18319字

摘 要

罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)为革兰氏阳性菌，是调节肠道功能的关键益生菌。罗伊氏乳杆菌活菌制剂产品普遍应用于食品、医疗等相干行业，改善和提高人体的健康水平。

本实验通过对不同保藏温度、保护剂的选择，及保护剂浓度梯度的挑选，并对罗伊氏乳杆菌进行梯度预冷处理和不预冻直接冷冻两种冷冻方式进行比较，经过10天、20天后菌种复苏，通过血球计数法测定存活率、比较细胞干重和菌液OD值，分析最佳的冷冻条件，保护剂类型以及保护剂浓度。

结果表明：选用海藻糖作为保护剂的罗伊氏乳杆菌的冷冻存活率明显高于在相同条件下使用其他保护剂的存活率；最佳保藏条件为：选用浓度为30%的海藻糖保护剂，经过预冷处理后，在-196 ℃液氮条件下保藏10天，乳杆菌存活率达到79.25%，活菌数达到2×10⁸ cfu/mL。

关键词：冷冻保藏 罗伊氏乳杆菌 存活率 生物量 冷冻条件

Effect of Freezing Storage Condition on the Performance of Lactobacillus reuteri

Abstract

Lactobacillus reuteri is a key probiotic that regulates intestinal function. Live L. reuteri products are widely used in food, medical and other related industries to improve and enhance the standard of the human healthy.

This experiment is based on the selection of different preservation temperatures, protective agents, and the concentration gradient of the protective agents, and the comparison of gradient freezing pretreatments with L. reuteri and direct freezing without freezing pretreatments. The genus species recovered after 10 and 20 days. The survival rate, the dry cell weight and the OD value of the broth are measured by hemocytometer method. The experiments are conducted to analyze the best freezing condition, protective agent type and protective agent concentration.

The results show:The survival rate of L. reuteri using trehalose as a protective agent is significantly higher than that of other protective agents under the same conditions. The best preservation conditions are as follows: After being pre-frozen, preserving L. reuteri with the trehalose protectant with a concentration of 30% at -196°C in liquid nitrogen for 10 days. The survival rate of Lactobacillus reached 79.25% and the number of live bacteria cells reaches 2×10⁸ cfu/mL.

Key words: Cryopreservation；Lactobacillus reuteri；Survival rate；Biomass；Freezing condition

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 罗伊氏乳杆菌简介 1

1.1.1 罗伊氏乳杆菌的发现 1

1.1.2 罗伊氏乳杆菌研究现状和用途 1

1.2 菌种保藏 2

1.3 影响乳酸菌冷冻后存活率的机制 2

1.3.1 机械损伤 2

1.3.2 溶质损伤 2

1.3.3 细胞代谢作用的损伤 3

1.3.4 pH的动态平衡被破坏 3

1.4 冷冻保护剂的使用 3

1.5 研究思路和意义 4

第二章 实验材料和方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 菌种 5

2.1.2 主要仪器与试剂 5

2.1.3保护剂类型 6

2.1.4 培养基成分 6

2.2实验方法 6

2.2.1菌种活化 6

2.2.2罗伊氏乳杆菌的生长曲线绘制 7

2.2.4细胞干重测定 8

2.2.5细胞存活率测定 8

第三章 结果与讨论 9

3.1罗伊氏乳杆菌生长曲线 9

3.2不同保护剂对罗伊氏乳杆菌存活率的影响 10

3.3不同保藏温度对罗伊氏乳杆菌存活率的影响 11

3.4不同冻存时间对罗伊氏乳杆菌存活率的影响 11

3.5问题与展望 12

参考文献 15

致谢 19

第一章 文献综述

1.1 罗伊氏乳杆菌简介

1.1.1 罗伊氏乳杆菌的发现

罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）是一种天然的革兰氏阳性细菌，广泛的在哺乳动物及鸟类的肠道中被发现^[1]。在1919年，L. reuteri被错误划分为发酵乳杆菌的一种。在1982年，Kandler 等人发现了L. reuteri和Lactobacillus fermentum的巨大差异，最终将L. reuteri单独分离鉴定出来。L. reuteri可以产生一类叫“reuterin”的广谱抑菌物，能够调节生物体肠道正常菌群、维持微生态平衡。同时“reuterin”能防止产生内毒素和有害微生物的生长。在食品工业中，L. reuteri不仅可以作为发酵剂，制成益生菌产品，而且也能够作为保健产品或者药品来改善和提高人体的健康水平^[2]。

1.1.2 罗伊氏乳杆菌研究现状和用途

在肠道健康方面，L. reuteri治疗儿童腹泻病的效果十分显著，可以降低症状持续时间。在预防肠道感染的情况中，比较研究发现使用L. reuteri比其他益生菌效果更加出彩。在大量的动物研究中，也发现L. reuteri能减少运动复合物，从而降低肠道蠕动，L. reuteri也是一种良好的治疗婴儿疝气的方法。研究表明，用L. reuteri医治的肠绞痛的初生儿，与用西甲硅酮或安慰剂治疗的初生儿相比，哭哭啼啼的时间明显减少，因为L. reuteri大量的存在于肠道内。越来越多的证据表明L. reuteri能够抵抗幽门螺杆菌，其引起的消化性溃疡在部分欠发达地区流行。一项研究显示，单独饮食补充L. reuteri可降低幽门螺杆菌（H.pylori）在肠道中的作用，并减少不良症状的产生，但不能根除。

在牙齿保护方面，L. reuteri已经被证明可以杀死一种导致蛀牙的变形链球菌，临床试验证明，口腔被通过L. reuteri定植的人的变形链球菌数量显著减少，短期的研究不能证明L. reuteri是否预防蛀牙^[3]。但是，由于它能够使一个引起牙齿退化的细菌的数量降低，这不会是意料之外的事情。

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