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摘 要

豆腐是中国的传统食品，随着时代的发展，豆腐生产逐渐规模化。豆渣是豆腐加工生产过程中的主要副产品。在过去，豆渣通常用作动物饲料，但是口感较涩、豆腥味重、难以储存等特点使其无法被高效利用。考虑到豆渣中纤维素及半纤维素所占比重较大，水解豆渣中的纤维素及半纤维素得到单糖，用于提供微生物发酵所需的碳源，将大大提高豆渣的有效利用率。

本实验以枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）为出发菌株，研究豆渣主要成份葡萄糖、木糖等分别做为碳源时对纳豆激酶合成的影响。经过实验发现，以葡萄糖为碳源时枯草芽孢杆菌生长及产酶达到最佳，木糖次之。基于此以葡萄糖作为碳源，优化豆渣添加量及发酵条件，最终发现当加入10 g/100 mL的豆渣，且温度为35℃、转速200 rpm、装液量为50 mL/500 mL、初始pH为7时，纳豆激酶产量最高。

关键词：豆渣 枯草芽孢杆菌 纳豆激酶

Study on the Utilization of different carbon sources by Bacillus subtilis and Optimization of fermentation conditions

ABSTRACT

Tofu is a traditional food in China. With the development of the times, tofu production is gradually large-scale. Bean dregs are the main by-products of tofu processing and production. In the past, soybean dregs were usually used as animal feed, but because of their astringent taste, heavy smell of beans, difficult to store and other reasons, the efficient utilization of soybean dregs could not be realized. Considering the large proportion of cellulose and hemicellulose in soybean dregs, hydrolysis of cellulose and hemicellulose in soybean dregs to obtain monosaccharide, which can be used to provide carbon sources for microbial fermentation, will greatly improve the effective utilization rate of soybean dregs.

In this experiment, Bacillus subtilis was used as the starting strain to study the effects of glucose and xylose, the main components of soybean dregs, on the synthesis of nattokinase. It was found that the growth and enzyme production of Bacillus subtilis were the best when glucose was used as carbon source, followed by xylose. Based on this, glucose was used as carbon source to optimize the addition of soybean dregs and fermentation conditions. It was found that when 10 g ≤ 100 mL soybean dregs were added, and the temperature was 35 ℃ and the rotating speed was 200 rpm, the initial pH of 50 mL/500 mL, was 7. The yield of nattokinase is the highest.

Keywords: bean residue, Bacillus subtilis, nattokinase

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 5

1.1 前言 5

1.2 枯草芽孢杆菌利用不同碳源的情况 5

1.3 豆渣的成分及其发酵 5

1.3.1 豆渣的成分 6

1.3.2 豆渣的发酵 6

1.4 枯草芽孢杆菌的概述 6

1.5 纳豆激酶的研究进展 7

1.6 研究内容和意义 7

1.6.1 研究内容 8

1.6.2 意义 8

第二章 实验材料与方法 10

2.1 实验材料 10

2.1.1 菌株 10

2.1.2 实验仪器 10

2.1.3 实验试剂 10

2.1.4 培养基 11

2.2 实验方法 12

2.2.1 培养方法 12

2.2.2 种子液制备及不同碳源利用研究 12

2.2.3 纳豆激酶的酶活测定 12

2.2.4 豆渣预处理 12

2.2.5 培养条件优化 12

2.2.6 发酵罐小试 12

2.2.7 豆渣中单糖检测 12

2.2.8 发酵相关数据分析 13

第三章 结果与讨论 14

3.1 产物定量分析——纳豆激酶 14

3.2 种子与发酵培养研究 14

3.2.1 菌株生长曲线的确定 14

3.2.2 发酵条件及结果分析 15

3.3 利用豆渣进行发酵培养的研究 16

3.3.1 豆渣的预处理 16

3.3.2 豆渣的添加量对发酵的影响 16

3.3.3 不同温度对发酵的影响 17

3.3.4 pH的变化对发酵的影响 18

3.3.5 装液量变化对发酵的影响 19

3.3.6 转速变化对发酵的影响 20

3.3.7 豆渣利用与7 L发酵实验 21

第四章 结论与展望 23

参考文献 24

致 谢 27

第一章 文献综述

1.1 前言

大豆是一种富含蛋白质的农产品，我国种植大豆已经有几千年历史，每年我国大豆进口量近9000万吨，是我国进口数量最多的农产品^[1]。随着人们对大豆营养成分的深入了解，以及我国豆类产品行业飞速发展，大豆消耗量也大量增加。豆渣则是大豆制品如豆腐干、豆腐、腐乳、豆乳等生产过程中数量最多的副产物(约占大豆干重15%~20%)，我国每年产0.2亿吨左右湿豆渣^[2]。虽然豆渣占农业废弃物的一大部分，但是由于其所含热能低，不易利用，且口感粗糙，所以在过去人们对它没有足够的重视。通常豆渣被人们用作辅料添加到饲料中，喂食给动物，使得豆渣中的营养成分难以被有效利用。在我国南方部分地区，豆渣甚至只能作为废弃物堆放，没有给与任何利用，这样不仅没有任何经济效益，而且造成了严重的环境污染。

由于豆渣充满豆腥味，且由于其水分含量较高不易保存，除少部分用于饲料行业，多数豆渣的无法得到充分利用。直接丢弃豆渣同样会造成资源浪费，不利于豆渣资源的高效利用^[3]。随着社会的发展和科技的不断进步，人们开始逐渐研究和发展新型资源，这使得豆渣有了充分利用的可能性，水解豆渣中的纤维素和半纤维素为发酵生产提供碳源，将大大提高豆渣的可利用性。

1.2 枯草芽孢杆菌利用不同碳源的情况

实验已经证明枯草芽孢杆菌在以木糖、果糖等作为唯一碳源和能源的培养基中是不能生长或者生长缓慢的，这是因为为了适应复杂的环境，微生物只有改善自身营养吸收和同化的能力，才可以在恶劣的环境中生产下来，枯草芽孢杆菌也是如此^[4]。随着细菌分裂的进行，子代菌株最终形成了一种糖代谢阻遏机制（Carbon Catabolite Repression，CCR），这种机制的存在可以让细菌能够优先利用最高效的碳源进行细胞代谢活动，让其得以快速的生长、繁殖，在优先级高的物质被耗尽后，才开始利用其他碳源进行生长^[5]。经过研究发现，当培养基中有葡萄糖时，枯草芽孢杆菌会优先利用葡萄糖，而减少或者不使用果糖、乳糖和木糖等次级碳源，也可以说枯草芽孢杆菌的糖代谢阻遏机制为葡萄糖阻遏机制^[6-7]。其中枯草芽孢杆菌的PTS (phosphoenolpyruvate(PEP):carbohydrate phosphotransferase system)转运系统与葡萄糖阻遏机制密不可分。正是这转运系统的存在，使得在葡萄糖存在的情况下菌株优先利用葡萄糖进行生长、发育，在葡萄糖耗尽之后，菌株还能够利用其它碳源维持细胞的基本代谢活动。在刘维喜等人^[8]的实验研究中，他们用枯草芽孢杆菌作为出发菌，用葡萄糖和木糖的作为碳源，组成混合液培养基进行发酵时发现，枯草芽孢杆菌优先利用葡萄糖，当优先碳源（葡萄糖）消耗完的时候，菌株并没有大量的吸收或者不吸收木糖以及没有出现二次生长的情况，这也证实了葡萄糖阻遏机制的存在。

1.3 豆渣的成分及其发酵

1.3.1 豆渣的成分

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