论文总字数：15432字

摘 要

几丁质又名壳多糖、甲壳素，它是自然界中广泛存在的一种天然高分子化合物，全球每年的生物合成量很大，却有很大一部分无法得到充分利用，所以如何对几丁质降解就成了全球关注的焦点问题。利用几丁质酶降解几丁质具有降解条件温和、对环境污染较轻、具有高度特异性等显著特点，因此，寻找新的能够产几丁质酶的菌株来源不仅是科研的关键问题，更具有无法替代的生产价值。

几丁质在海洋中的生物合成量占总合成量的比例较高，并且海洋微生物可以很好地分解几丁质残余。所以，从海洋环境中遴选可以生产几丁质酶的微生物就有着很重要的科研价值。本课题从武汉取得的深海海洋菌样本中通过筛选获得了8株能够分解几丁质的菌株，对这些菌株进行形态观察、生理生化鉴定以及PCR凝胶电泳，确定了筛出菌株的种属，其中透明水解圈最大的10号菌株为蜡状芽孢杆菌。此次研究的意义是扩展产几丁质酶菌株的来源，为大规模生产几丁质酶做好相应准备。

关键词： 几丁质酶；海洋菌；筛选；鉴定

Screening and Identification of Marine bacteria producing chitinase

Abstract

Chitin, also known as chitosan and chitin, is a kind of natural macular compound widely existing in nature. There is a large amount of global biosynthesis every year, but a large part of it cannot be fully utilized. Therefore, how to degrade chitin has become the focus of global attention. The outstanding features of decomposing chitin by mean of chitinase are gentle degradation conditions, Light pollution to the environment and having high specificity. So,Finding a new source of chitinase producing strain is not only a key problem in scientific research, but also has the value of large-scale production.

Chitin accounts for a large proportion in Marine biosynthesis and Marine microorganisms can degrade chitin well. Therefore, it is of great scientific value to select microorganisms that can produce chitinase from the Marine environment. In this project, 8 strains that can decompose chitin were selected from the samples of deep-sea Marine bacteria obtained from wuhan, and the species and genus of the screened strains were determined through observation of the morphology of these strains, biochemical identification and PCR electrophoresis. The bacteria that can produce the biggest hydrolysis circle is Bacillus cereus ,the NO.10 bacterial strain. The significance of this study is to expand the source of chitinase producing strains and prepare for mass production of chitinase.

Keywords: Chitinase; Marine bacteria; Screening; Identification

目 录

摘要…………………………………………………………………………………I

ABSTRACT………………………………………………………………………II

第一章 文献综述………………………………………………………………1

1.1 几丁质和几丁质酶简介……………………………………………………1

1.2 几丁质酶分类………………………………………………………………1

1.3 几丁质酶性质………………………………………………………………2

1.4 几丁质酶应用………………………………………………………………2

1.5 已筛出产几丁质酶的菌株简介……………………………………………3

1.6 立题背景与意义……………………………………………………………3

1.7 本课题研究内容……………………………………………………………3

第二章 实验材料与方法………………………………………………………5

2.1材料…………………………………………………………………………5

2.1.1 实验材料……………………………………………………………5

2.1.2 培养基的配制………………………………………………………5

2.1.3 胶体几丁质制备……………………………………………………5

2.1.4 培养基高压蒸汽灭菌、倒平板……………………………………5

2.1.5 实验仪器……………………………………………………………6

2.1.6 实验药品……………………………………………………………6

2.2 实验方法……………………………………………………………………7

2.2.1 海洋菌的活化………………………………………………………7

2.2.2平板初筛……………………………………………………………7

2.2.3平板复筛……………………………………………………………7

2.2.4 16S rRNA鉴定……………………………………………………8

2.2.5 生理生化鉴定……………………………………………………10

第三章 实验结果与分析……………………………………………………12

3.1海洋菌活化…………………………………………………………………12

3.2选择培养基初筛……………………………………………………………15

3.3平板复筛……………………………………………………………………17

3.4 PCR分析……………………………………………………………………18

3.4.1总DNA凝胶电泳…………………………………………………18

3.4.2 PCR凝胶电泳……………………………………………………18

3.5 16S rRNA鉴定结果与分析………………………………………………19

3.6生理生化鉴定结果…………………………………………………………21

第四章 结论与展望……………………………………………………………22

致谢………………………………………………………………………………23

参考文献…………………………………………………………………………24

第一章 文献综述

1.1几丁质和几丁质酶简介

几丁质是自然界中广泛存在的一种天然高分子化合物，是N-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖[1]。甲壳素是仅次于纤维素的第二大天然高分子多糖材料，它主要构成真菌细胞壁以及普遍存在于虾、蟹、昆虫等动物外壳中[1]。它是一种性质稳定，生理活性强的高分子化合物[2]。全球每年由生物合成的甲壳素约为100亿吨[3]，且我国虾蟹工业生产活动中会产生大量废弃物，其中就包含需要降解的几丁质。几丁质性质十分稳定，同时它在水中的溶解度很低，所以应用面比较狭窄。为此,需要把几丁质降解成为更易于吸收利用的几丁寡糖，更为重要的是，几丁寡糖具有抗癌活性、抗真菌活性、免疫调节和植物生长调节等作用[4]。

几丁质酶又可称做甲壳素酶，是1929年卡乐和霍福曼第一次从一种叫做Helixpomatia（盖罩大蜗牛）的蜗牛胃液中发现的有机物质。几丁质酶可以催化水解几丁质，几丁质的天然降解途径主要是通过微生物产生几丁质酶从而将几丁质降解成几丁质寡糖和单糖。几丁质酶广泛存在于生物体中, 如细菌、真菌、酵母、植物、放线菌、节肢动物和人类等[5]。

1.2几丁质酶分类

根据几丁质酶作用时的切割位点不同, 可将几丁质酶分为内切几丁质酶和外切几丁质酶和 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶[6]。内切几丁质酶在几丁质内部任意位置产生切割作用，主要作用于几丁质内部的β-1,4-糖苷键，从而形成二乙酰基壳二糖和可溶的低分子壳寡糖（如壳三糖和壳四糖等）[7]。外切几丁质酶可分为两类: 催化加速几丁质从非还原性末端释放二乙酰基壳二糖（Diacetylchitobiose）的几丁质水解酶[8]。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶同时具有几丁质内切酶和几丁质外切酶两种特性，水解终产物包括几丁二糖、几丁三糖等低聚糖[6]。

1.3 几丁质酶性质

几丁质酶的分子质量一般在20～120 ku之间，其中细菌的几丁质酶多为 60～110 ku，放线菌的多为30 ku或更低，真菌的一般大于30 ku，植物几丁质酶也在30 ku 左右，昆虫几丁质酶的分子量较大，一般大于50 ku[9]。

几丁质酶对环境酸碱条件变化的敏感性不会因为种类不同而存在很大差别。一般几丁质酶的最适pH范围约为3.5-9.0。然而，几丁质酶对环境温度变化会有比较强烈的反应，具体表现在随着环境温度的升高，几丁质酶活先上升到达最高点（约30-40 ℃），接着酶活不断降低。当温度过高时，几丁质酶的酶活完全丧失。大量文献显示重金属离子对几丁质酶活有较强影响力，能够降低几丁质酶酶活，相反，Mg² 、Ca² 及 Mn² 则具有增强几丁质酶酶活的作用，因此，不能一概而论金属离子对几丁质酶具有抑制作用还是激活作用[6]。

同时几丁质酶还具有诱导性，许多研究都证明，脊椎动物和植物中的几丁质酶是可诱导的，高等植物在受到病原物及其激发子、乙烯、水杨酸、紫外线、重金属、脱已酰几丁质、某些盐溶液、机械损伤等诱导后，几丁质酶的活性迅速提高，在一定程度对植物起防御和保护的作用[10]。

1.4 几丁质酶应用

随着科技不断进步，几丁质酶在食品工业、化妆品生产、饲料改良、防治真菌、生物防治、抗病基因工程等领域的重要地位日益显著。

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