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摘 要

近年来对分子靶向抗肿瘤药物的研究逐渐兴起，虽然其毒副作用弱于传统的细胞毒类药物，但是分子靶向药物仍会造成一定的不良反应。瑞戈非尼是小分子靶向药物中的多靶点抗肿瘤药，其药理作用广泛，可以干扰体内细胞增殖和调亡周期，影响多条信号通路的传导，阻断血管新生使细胞失去血氧供应从而产生较强的抗肿瘤作用，但同时其造成的毒副作用也会较大。

本研究将转基因斑马鱼Tg（flk-1：EGFP）作为研究对象，通过体式镜评价瑞戈非尼对胚胎的整体毒性，以胚胎心脏停止跳动或者卵凝结为死亡判定标准，以体轴弯曲、发育迟缓、心包及卵黄囊水肿等形态学异常为畸形判定标准,数据显示胚胎致畸率和药液浓度呈正相关。并且运用荧光显微镜观察得到的绿色荧光强度随瑞戈非尼浓度升高而减弱表明药液对斑马鱼胚胎体节间和肠下网血管发育抑制作用逐渐增强，进一步为临床患者用药提供相关资料，提高临床患者的耐受性和生存质量。

关键词：多靶点抗肿瘤药 瑞戈非尼 斑马鱼 倒置荧光显微镜

Developmental Toxicity Evaluation of Multiple Target Antitumor Drug Regofinil on Zebrafish Embryos

Abstract

In recent years, the research of molecular targeted anti-tumor drugs has been rising gradually. Although the side effects of molecular targeted anti-tumor drugs are weaker than those of traditional cytotoxic drugs, they still cause some adverse reactions. Regofinib is a multi-target anti-tumor drug among small molecule targeted drugs, which has a wide range of pharmacological effects.It can make cell proliferation and modulation of death cycle disorder, the cellular pathway layer upon layer of transmission will produce abnormal conditions, block angiogenesis at the same time, and make cells lose blood oxygen supply, so it has a strong anti-tumor effect, but at the same time, it will cause more side effects.

In this study, transgenic zebrafish Tg (flk-1: EGFP) was used as the research object, and the overall toxicity of regofinib to embryos was evaluated by means of body mirror. The death criteria were fetal cardiac arrest or egg coagulation, and the deformity criteria were body axis bending, growth retardation, pericardial and yolk sac edema.If the drug concentration goes up, so does the rate of embryo malformation.The specific growth inhibition of intersegmental vessels and subintestinal reticular vessels can be analyzed by the intensity of green fluorescence observed by fluorescence microscope as the drug density changes .The toxic effect of the drug on zebrafish embryos can be compared and analyzed in clinical patients,in order to improve the tolerance and quality of life of clinical patients.

Key Words: Multitarget antitumor drugs; Regofini; Zebrafish; Inverted fluorescence Microscope

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 分子靶向抗肿瘤药物研究 1

1.1.1 分子靶向药物分类 1

1.1.2 分子靶向抗肿瘤药物毒性研究现状 1

1.2 模式生物斑马鱼研究 3

1.2.1 斑马鱼生物学特性 3

1.2.2 胚胎发育技术 3

1.2.3 斑马鱼发育遗传学 3

1.2.4 转基因斑马鱼发展 3

1.3 斑马鱼及其胚胎在毒理学评价中的应用 4

1.3.1 斑马鱼胚胎毒理学应用总论 4

1.3.2 有机化合物对斑马鱼及其胚胎毒性评价 4

1.3.3 分子靶向药物对斑马鱼毒性评价 5

1.4 实验目的与意义 5

第二章 材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 实验试剂 6

2.1.2 实验仪器 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 主要试剂的配制 7

2.2.2 斑马鱼胚胎的培养 7

2.2.3 斑马鱼的急性毒性 7

2.2.4 斑马鱼胚胎血管发育评价 8

2.2.5 统计学方法 8

第三章 结果与讨论 9

3.1 结果 9

3.1.1 胚胎整体毒性 9

3.1.2 斑马鱼胚胎的血管发育影响 10

3.2 讨论 13

第四章 总结与展望 14

4.1 总结 14

4.2 展望 14

参考文献 15

致谢 19

第一章 文献综述

1.1 分子靶向抗肿瘤药物研究

1.1.1 分子靶向药物分类

随着对于恶性肿瘤的原始发生分子机制和与肿瘤相关的细胞信号通路认识越来越全面，抗肿瘤的分子靶向药物也逐渐多应用于临床，这些靶点包括相关的细胞受体、细胞信号通路上的调控分子等，这种治疗方法人们称之为“分子靶向治疗”。同时随着科技的日渐成熟，分子靶向药物已获得了重大且具有突破性的进展，临床反馈的治疗效果较佳^[1]，为肿瘤治疗开启了希望之门^[2]。这类药物的设计思路有很多，包括影响细胞生长周期与调亡效应、细胞内多条交叉信号通路、新生血管的生成以及细胞与细胞基质外相互作用的关键蛋白质分子，甚至可以是一段关键基因^[3]。根据基因工程技术和化学药物合成技术的不同可以将分子靶向药物分为单克隆抗体和小分子化合物两类。

本课题重点研究小分子药物的药理作用，其中单靶点药物有针对BCR-ABL酪氨酸激酶的伊马替尼^[4]，阻断表皮生长因子受体的吉非替尼等^[5]。但是根据诸多临床数据表明单靶点抑制剂治疗肿瘤效果不佳，所以多靶点抑制剂如索拉非尼、舒尼替尼和瑞戈非尼等已经逐渐成为临床用药的良好选择之一，这些多靶点抗肿瘤药影响VEGF、PDGF、FLT和KIT等多条信号通路，因而产生的抗肿瘤活性也更加广泛。

1.1.2 分子靶向抗肿瘤药物毒性研究现状

分子靶向药由于具有特异靶向性在正常组织不表达或低表达，其造成的不良反应比没有精确靶向作用的细胞毒类药物要低，但分子靶向治疗仍对身体循环组织系统、内分泌系统等诸多系统造成一定的毒副作用。表皮生长因子的药物大多会造成皮肤毒性，如单抗类的西妥昔单抗，小分子靶向的吉非替尼等，手足综合征是多靶点抗肿瘤药物会容易导致的不良反应^[6]。对于细胞毒类药物而言，胃肠道毒性是其常见的不良反应，这个特点同样适用于分子靶向药物，其中腹痛腹泻为最常见的症状^[7]。心血管毒性主要指标有血压上升、心肌细胞耗氧和供氧失衡、心力衰竭、左心室射血分数下降和心电图QT间期间隔升高等^[8]。有研究显示一线治疗晚期非小细胞肺癌治疗药替尼类如埃克替尼等不光会造成常见的皮肤毒性反应、胃肠道毒副反应外，还出现口腔黏膜炎^[9]。我们还要重视一些潜在的不良反应，如胃肠道间质瘤患者使用伊马替尼后可出现严重的肝毒性，不同药物之间有所不同，主要与药物机制，药物类别密切相关。

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