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摘 要

α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, EC 3.2.1.20）又叫α-葡萄糖苷水解酶或者是葡萄糖基转移酶（GTase），是一种天然构型为D形的α-葡萄糖苷酶，它可以从一些低聚糖作为底物的非还原性末端释放α-葡萄糖，也可以通过转糖基的作用把葡萄糖基从聚糖底物中转移到受体形成低聚糖或糖脂、糖肽等等。α-葡萄糖苷酶在自然界中普遍存在，而且种类多，比如作为药材的枸杞中，还有我们平时吃的大米中都有发现。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一，迄今已有200多种外源蛋白在毕赤酵母中获得表达。由于毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白且纯化方便，所以本实验采用毕赤酵母表达系统表达目的蛋白。

本实验课题将来源于Oryza sativa的α-糖苷酶基因序列在毕赤酵母GS115中进行转化、表达，筛选P. pastoris中高表达、高酶活的菌株，对其进行纯化后研究其酶学性质。结果发现，经Ni-NTA纯化后的α-糖苷酶的比酶活达1.86 U/mg。并以抗坏血酸钠、麦芽糖为底物在α-糖苷酶转糖基作用下催化合成AA-2G。

关键词：α-葡萄糖苷酶；毕赤酵母GS115；AA-2G。

ABSTRACT

Alpha-Glucosidase (α-Glucosidase, EC 3.2.1.20), is a natural D-shaped α-glucosidase, which can release α-glucose from the non-reducing end of some oligosaccharides as a substrate, and can also transfer the glucosyl group from the glycan substrate to the receptor through the action of transglycosylation to form oligosaccharides or glycolipids, glycopeptides and many more. Alpha-glucosidase is ubiquitous in nature, and there are many types, such as the wolfberry as a medicinal material, and the rice we usually eat.

The Pichia pastoris expression system is one of the standard tools for expressing recombinant proteins in the field of molecular biology. To date, more than 200 foreign proteins have been expressed in P. pastoris. It can express foreign proteins at a high level and is easy to purify, so here we use P. pastoris expression system to express the target protein.

In this paper, the sequence of α-glycosidase from Oryza sativa was optimized and synthesized, then constitutive expression were carried out in P. pastoris GS115. Strains with high enzyme activity and highly expressed were screened out. After purification by Ni-NTA, their enzymatic properties and kinetic parameters were characterized and studied. The results showed that the specific enzyme activity of α-glycosidase reached 1.86 U/mg. AA-2G was synthesized by transglycosylation of α-glycosidase using sodium ascorbate and maltose as substrate.

Keywords : α- glucosidase; GS115; AA-2G; Pichia pastoris

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2 α-糖苷酶的来源和性质 1

1.3毕氏酵母表达系统 2

1.4 AA-2G 2

1.5本课题研究的意义和思路 4

第二章 重组质粒在毕赤酵母中的分泌表达 5

2.1前言 5

2.2材料与方法 5

2.2.1实验仪器 5

2.2.2实验试剂 6

2.2.3菌体与质粒 7

2.2.4工具酶和试剂盒 7

2.2.5培养基配制 7

2.3实验方法 8

2.3.2 质粒扩增及质粒小提 9

2.3.3质粒线性化 9

2.3.4 GS115 感受态制备 10

2.3.5电转 10

2.3.6目的菌株的筛选 10

2.3.7 PCR鉴定 11

2.4 结果与分析 12

2.4.1质粒抽提结果 12

2.4.2 质粒线性化及胶回收检测结果 12

2.4.3 菌落PCR鉴定结果 13

2.4.4 Bradford法测定蛋白浓度 15

2.4.5 SDS-PAGE凝胶电泳结果 16

2.4.6小体系反应测酶活性 16

2.5本章小结 17

第三章α-糖苷酶催化合成AA-2G 18

3.1前言 18

3.2.1实验仪器 18

3.2.2实验试剂及培养基 19

3.3 实验方法 20

3.3.1 粗酶纯化 20

3.3.2蛋白电泳 21

3.3.3催化合成 AA-2G 21

3.3.4.HPLC检测方法 21

3.4结果与分析 21

3.4.1 纯酶蛋白浓度测定结果和SDS-PAGE凝胶电泳结果 21

3.4.1 AA-2G的HPLC检测 22

3.4本章小结 23

第四章 结论与展望 24

4.1主要结论 24

4.2展望 24

参考文献 25

致 谢 28

第一章 文献综述

1.1前言

α-葡萄糖苷酶，它可以从一些低聚糖作为底物的非还原性末端释放α-葡萄糖，所以也叫葡萄糖苷水解酶或者葡萄糖苷转移酶。其功能主要是能水解麦芽糖一类的低聚糖分子结构中α-1，4糖苷键，并能将游离出来的一个葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子上^[1-4]。研究发现灵长类动物对一些碳水化合物的吸收利用与α-葡萄糖苷酶有着很大关系 ^[5]。

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