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制备具有增强的抗病毒活性的阿昔洛韦前药：

合理的设计，合成，人血浆稳定性和体外评价

Radoslav L. Chayrov1·Evgenios K. Stylos5,6·Maria V. Chatziathanasiadou5·Kiril N. Chuchkov1 ·Aleksandra I. Tencheva1Androniki D. Kostagianni5Tsenka S. Milkova1·Assia L.Angelova2,3·Angel S. Galabov3·Stoyan A. Shishkov4 ·Daniel G. Todorov4Andreas G. Tzakos ·Ivanka G. Stankova1

概要：

胆汁酸前药已经成为通过利用来改善母体药物的药物谱的可行策略胆汁酸转运蛋白。一系列三种酯类前药的抗疱疹药物阿昔洛韦（ACV）与胆汁酸胆碱，合成鹅去氧胆酸和脱氧胆酸并与伐昔洛韦一起评价其体外抗病毒活性针对单纯疱疹病毒1型和2型（HSV-1，HSV-2）。三种胆汁酸的体外抗病毒活性还评估了前药对抗Epstein-Barr病毒（EBV）。等离子体稳定性测定，利用超高性能液相色谱与串联质谱联用，进行体外细胞毒性和抑制实验为了建立ACV前药的生物学特性。抗病毒测定证明ACV-胆酸盐抗ACV治疗HSV-1的抗病毒活性稍好一些，而相对于HSV-1活性则高8倍针对HSV-2的ACV。 ACV-鹅脱氧胆酸盐对HSV-2的抗病毒活性提高了6倍ACV。关于EBV，ACV-鹅脱氧胆酸盐证实了最高的抗病毒效果。人体血浆稳定性测定显示ACV-脱氧胆酸盐比其他两种前药更稳定。这些结果表明装饰具有胆汁酸的ACV的核心结构可以递送具有增强的抗病毒活性的前药。

关键词：

阿昔洛韦·前药·血浆稳定性·HSV-1·HSV-2·Epstein-Barr病毒

缩写：

ACV-------------阿昔洛韦，

HSV-1-----------单纯疱疹病毒1型，

HSV-2-----------单纯疱疹病毒2型，

EB---------------病毒Epstein-Barr病毒，

LC-MS / MS-------液相色谱 - 串联质谱法，

RT---------------保留时间，

Mu;RM-------------多反应监测，

MTC-------------最大耐受浓度，

MIC--------------最低抑菌浓度

介绍：

阿昔洛韦（ACV）是一种有效的治疗药物可治疗疱疹病毒引起的感染，如单纯疱疹1和2，水痘 - 带状疱疹病毒，6型和7型疱病毒，EBV等（Kimberlin和Whitley 2007）。尽管有效，但其具有极低的水溶性（lt;1.3 mg / mL）和较差的口服生物利用度。这些阻碍了其开发利用完整的治疗窗口（de米兰达等人1981年，1982年;布鲁尼等人。 2013; Bras等人2001）。 ACV溶解性差，胃肠道吸收低和薄膜渗透性差有关在高剂量给药后有严重的副作用人体内的剂量，如恶心，呕吐，腹泻，流失食欲，胃痛等（de Miranda和Blum 1983;Klysik等人。 2018;约翰斯顿等人。 2012）。而且据报道，它口服生物利用度变化很大从狗的75.3plusmn;1.3％到恒河猴3.7plusmn;0.5％（de Miranda和Blum 1983;de Miranda等1981，1982年）。在人类ACV中口服生物利用度由于肠道减少，仅限于20％渗透性，因此用于有效治疗，200毫克剂量每天需要五次（de Miranda和Blum 1983;金伯林和惠特利2007）。因此，有几种策略包括配方和已经开发出“前药”方法作为可行的替代方案加强ACV的交付（Beauchamp等。1992; Park等。 1992; Colla等人。 1983; Bando等。 1994;邵等人。 1994;卡拉曼等人。 2012;桑托斯等人。 2009）。活跃的营养物质运输系统已成为一种前景由于最近的进展，前药设计的目标识别和cloni各种载体的cDNA（Yang et al.2001）。沿着这些方向，它最近已经出现报道称口服氨基酸酯前药ACV增加其在没有的大鼠的尿排泄前药检测，表明这些酯受到了影响广泛的体内水解（Burnette和de Miranda1994; Beauchamp等人。 1992; Beauchamp和Krenitsky1993; Katragadda等人。 2008）。已经描述了成功的前药方法伐昔洛韦，成功提高口服生物利用度父母的ACV为54％（Soul-Lawton等，1995; Han等。 1998; Bomgaars等人。 2008;安特曼和古德蒙森2007）。伐昔洛韦是ACV的l-缬氨酸酯前药靶向存在于肠中的hPepT1肽转运蛋白（Han et al.1998; Guo et al.1999）。也是口服给药l-valine-ACV的产生尿量增加最多在检查的氨基酸中排泄ACV（~63％）ACV的酸酯前药（Soul-Lawton等，1995; Han等。 1998）。胆汁酸属于另一种类型的scafolds已被用于前药制剂中，通过增强通过特定的方式吸收与之缀合的分子运输路线。具体而言，胆汁酸是类固醇来自胆固醇分解代谢的羧酸，这有利于脂质和脂质的消化和吸收脂溶性维生素，它们通过两种活性物质转移肠肝循环期间的被动运输过程（St-Pierre et al.2001; Hofmann 1988; Carey andCahalane 1988; Turley和Dietschy 1988; Petzinger 1994;Stedronsky 1994;恩赫森等人。 1998; Staels和丰塞卡2009年;蒋2009）。发生这些运输过程通过介导化合物的Na 依赖性转运蛋白从门静脉循环进入肝细胞以及从肠道和肠道的化合物重吸收胆管上皮和ATP依赖性转运蛋白将胆汁酸加入胆汁中。除了这些类转运蛋白，Na 非依赖性有机阴离子载体还确定了广泛的多基质特异性（St-Pierre等人，2001年）。胆汁酸肠道吸收涉及Na / K -ATP酶和人顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白（hASBT）（Lack 1979; Love和道森1998; Balakrishnan和Polli 2006;杜安等。 2007）。有几份报道调整具有增强的抗病毒活性的阿昔洛韦前药：合理的设计，合成，... 11331 3主要表现在小肠和较小的肝细胞程度（Bockman等，1997; Thamotharan等。 1997;梁等人。 1995;王等人。 2017年）。沿着这些方向，本研究的目标是合成ACV的胆汁酸前药并评估它们的作用体外抗HSV-1，HSV-2和EBV的效力。我们的目标提高ACV的药学特性利用已建立的胆汁酸前药策略通过使用这种前药的口服生物利用度人类顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白（Tolle-Sander等人，2004年）。为此目的，三种胆汁酸（胆碱，脱氧胆酸，鹅去氧胆酸）用于治疗ACV前药的合成。内在的两亲性胆汁酸，其刚性甾体骨架和类固醇环上的羟基可以被官能化以各种方式，对映体纯度和低成本制造它们是与ACV结合的理想构建模块（Davis1993;李和迪亚斯1997; Wallimann等人。 1997;塔米宁和Kolehmainen 2001; Virtanen和Kolehmainen 2004;Mukhopadhyay和Maitra 2004）。评估了三种合成的胆汁酸ACV前药因为它们对HSV-1，HSV-2的生物学效率和EBV以及它们对正常细胞的细胞毒性作用。还评估合成的缀合物的稳定性在人血浆中通过建立进行UHPLC-MS / MS分析。材料和方法化学品和试剂ACV（纯度ge;99％），盐酸伐昔洛韦（ge;98％）纯度）和胆汁酸（胆碱，脱氧胆酸，鹅去氧胆碱）购自Sigma-Aldrich。 4-二甲基氨基（DMAP）和N，N#39;-二环己基碳二亚胺（DCC）购自默克公司。甲酸（98％，LC-MS级）和二甲基甲酰胺（DMF）从Fluka获得。乙腈，甲醇，去离子水，LC-MS等级全部，购自Fisher Scientifc。DMSO（LC-MS级）购自Thermo科学。膜过滤器，孔径为0.2mu;m直径47毫米购自Phenomenex。高纯度氩用作碰撞气体。 TLC分析是在铝硅胶60 F254板（默克）上进行使用254nm的UV灯进行检测。来自健康供体的无药物人血浆的稳定性研究，是一种来自血液捐赠中心的人约阿尼纳大学医院。制备ACV的一般合成方法前体药物胆汁酸（0.480 g，2 mmol）和DCC（0.191 g，搅拌2摩尔浓度的DMF溶液在氮气下0℃下1小时气氛（图1）。 ACV溶液（0.225 g，1 mmol）向DMF中加入DMAP（0.244g，2mmol）的DMF溶液将反应混合物搅拌24小时。然后蒸发DMF在真空中，并将残余物在硅胶上纯化图1胆汁酸和ACV的化学结构1134 R. L. Chayrov等。1 3色谱法，使用MeOH / CH 2 Cl 2（1：4）的梯度。用于鉴定三种类似物NMR和质量应用光谱测定法。 1H，13C NMR谱在Bruker Avance DRX-500光谱仪上获得，操作在500.13 MHz。获得ESI质谱关于布鲁克EVOQ Elite ER TQ。获得IR光谱在Thermo Scientifc Nicolet iS10 FT-IR上。LC-MS / MS分析液相色谱条件进行反相液相色谱测定使用Bruker Advance超高效液体色谱（UHPLC）系统（Bruker，Germany）。 Tau;he进行ACV酯和伐昔洛韦的分离在Kinetex C18色谱柱上，100 mmtimes;2.1 mm，2.6 um，带有proguard柱2.1毫米（Phenomenex）。柱温保持稳定在40℃。流动阶段由去离子水和甲酸0.1％组成（A）和乙腈与甲酸0.1％（B）。对于渐变三种胆汁酸酯的洗脱，如下所示使用的恒定流速为200uL / min：初始阶段（B）浓度20％，在2.0分钟内增加到100％，然后保持恒定2分钟并减少到20％直到结束在5分钟的运行。对于伐昔洛韦的分离，以200uL / min的恒定流速进行以下梯度使用：初始阶段（B）浓度5％，增加到70％在2.0分钟内，然后保持恒定2分钟并减少至5％直到运行结束。注射量设定为5 uL，而自动进样器的温度为保持在25°C。质谱条件用于四种前药的电离和检测，EVOQ精英ER（布鲁克）三重四极杆质谱仪以正电离电喷雾模式（ESI ）进行操作多反应监测（MRM）。使用MRM构建器，布鲁克MS工作站软件的一个特点，是最优的选择MRM转换以监控四种类似物对于ACV-胆酸盐，m / z 616→562.3和616→152.1，ACV-脱氧胆酸盐600→564.2和600→582.2，ACV-鹅脱氧胆酸盐600→582.3和600→564.3伐昔洛韦的325.1和152.2和325.1→146.3。最佳ESI条件如下测定：喷雾电压4500 V;加热探针气体，50个单位;加热探针温度350°C;锥形气体，20个单位;锥温，350°C;雾化器燃气，50个单位。完全控制LC和MS也用数据采集进行MSBR软件，版本8.2.1，由Bruker提供。人体血浆对ACV酯和伐昔洛韦的稳定性每种化合物的储备溶液为1mg / mL通过将适量的溶解在DMSO中制备。60 uM的最终工作溶液用甲醇进一步稀释储备溶液。等离子体通过温育10uL每种类似物制备样品单独使用90 uL人血浆（pH调节至7.4）在37℃下0,1,2,3,5,7,14,18小时。为了淬火反应，每次加入500mu;L冷冰乙腈样品，每种分析物的最终浓度为1 uM。然后将样品涡旋混合并离心在10,000g，5分钟。取出上清液，过滤并转移到小瓶中进行UHPLC-MS / MS分析。每一式三份研究样品和百分比图在每个时间点保留的母体化合物与0时间相比，时间设计为四种化合物。测定合成的抗病毒活性ACV和伐昔洛韦对HSV-1的酯和HSV-2病毒和细胞两个实验室菌株Da（HSV-1）和Bja（HSV2），由S. Dundarov教授（国民议员）友情提供传染病和寄生虫病中心，NCIPD，保加利亚）。Madin-Darby牛肾（MDBK）细胞是在RPMI-1640培养基中以37℃培养为单层（Flow Laboratories，USA），补充抗生素（青霉素：100 IU / mL，链霉素：100 ug / mL）和10％牛血清（NCIPD，保加利亚）。血清浓度为减少到5％，以检查病毒的增长并鉴定合成的酯和的细胞毒性伐昔洛韦。细胞毒性测定 - 最大值的测定可耐受浓度（MTC）为了确定和比较最大可容忍度化合物的（无毒）浓度（MTC）值ACV，未感染的confuent细胞单层细胞覆盖着含有不同浓度的媒体测试化合物（1.6-162.3mu;M，用于ACV-胆酸盐）和ACV-脱氧胆酸盐和ACV-鹅脱氧胆酸盐1.7-166.7mu;M）或ACV（4.4-88.8mu;M）并在37℃下培养持续96小时在无前体药物培养基中生长的细胞样品作为控制。最大无毒浓度，WHich没有改变形态和生存能力将细胞确定为MTC。调整具有增强的抗病毒活性的阿昔洛韦前药：合理的设计，合成，... 11351 3抗病毒测定实验在多周期生长条件下进行。洗涤并感染Confurent细胞单层每0.1 mL含320细胞培养感染剂量（CCID50）适当的病毒株（Da和Bja）。 1小时后，细胞包含四个维护媒体ACV的前药（合成酯和伐昔洛韦）测试浓度（A​​CV-胆酸盐为1.6-162.3mu;M，对于ACV-脱氧胆酸盐和ACV-鹅脱氧胆酸盐，1.7-166.7mu;M伐昔洛韦3.1-61.7 uM）。效果48小时后测定病毒复制（对于菌株Da和Bja）通过减少感染性病毒在37°C培养滴度与未处理

资料编号：[5284]