摘 要

本实验通过利用DNA条形码技术，对不同来源未知的51份樱属植物样品进行物种鉴定以及构建樱属植物的鉴定体系。采用试剂盒法提取樱属植物样品的总DNA。利用PCR技术扩增样品总DNA的ITS2序列以及psbA-trnH序列，后进行双向测序。所得的DNA条形码序列经CodonCode Aligner软件拼接并剪切后，获得高质量的ITS2序列以及psbA-trnH序列。利用NCBI GenBanks数据库进行物种鉴定。后采用MEGA5.1软件进行序列对比分析，计算K2P遗传距离，分析比较样品植物属间、种间以及种内序列差异，利用邻接法（NJ）构建系统聚类树，分析并建立起樱属植物的鉴定体系。本实验通过分析研究样品遗传距离关系，分析发现可通过利用ITS2序列鉴定样品植物是否属于樱属植物，并且利用ITS2序列以及psbA-trnH序列结合，可用于鉴定樱属植物属内的具体物种。本实验最终通过以ITS2序列为主、psbA-trnH序列为辅，通过系统进化树树图分析，构建起一个基础的樱属植物鉴定系统。为更加精确、广泛、快捷的樱属植物鉴定体系提供基础，更为樱属植物的开发利用提供有利的环境。

关键词：樱属植物；DNA条形码；ITS2序列；psbA-trnH序列；物种鉴定

Abstract

In this experiment, the identification of 51 unknown samples of Sakura plants and the identification system of Sakura plants were carried out by using DNA barcode technology.Total DNA was extracted using the kit method.The ITS2 sequence and the psbA-trnH sequence were amplified by PCR to perform bidirectional sequencing.The resulting sequence was spliced and cut by CodonCode Aligner to obtain the ITS2 sequence and the psbA-trnH sequence, and the NCBI GenBanks database was used for species identification.The MEGA5.1 software was used to compare the sequence, calculate the genetic distance of K2P, analyze and compare the intergeneric, interspecies and intraspecific intraspecific differences. The neighboring method (NJ) was used to construct the system clustering tree to analyze and establish the identification of Sakura. system.In this experiment, the genetic distance relationship of the sample was analyzed, and the ITS2 sequence was used to identify whether the plant belongs to the genus Sakura, and the combination of the ITS2 sequence and the psbA-trnH sequence can be used to identify certain specific species within the genus Sakura.In this experiment, a basic Sakura plant identification system was constructed by using the ITS2 sequence as the main component and the psbA-trnH sequence as the supplement, and through the phylogenetic tree diagram analysis.It not only provides a basis for a more accurate, extensive and rapid identification system of Sakura plants in the future, but also provides a favorable environment for the development and utilization of medicinal plants of Sakura.

Key words Cerasus Mill; DNA barcoding; ITS2; psbA-trnH; species identification

目录

第一章 绪论 1

1.1 樱属植物概述以及研究现状 1

1.2 DNA条形码技术 1

1.2.1 DNA条形码技术的概念 1

1.2.2 DNA条形码技术的优点 2

1.2.3 中药材鉴定中DNA条形码技术应用概述 2

1.2.4 ITS2序列和psbA-trnH序列简介 3

1.3 研究的内容、目标及意义 3

第二章 樱属植物DNA条形码实验研究 4

2.1实验原理 4

2.1.1 DNA条形码原理 4

2.1.2 植物总DNA提取方法 4

2.1.3 DNA检测方法 4

2.1.4 PCR原理 5

2.1.5 测序原理 5

2.2 实验材料 5

2.2.1樱属植物采集，保存 5

2.2.2 仪器与试剂 6

2.3 实验方法 8

2.3.1 实验技术路线 8

2.3.2 DNA提取 8

2.3.3 ITS2和psbA-trnH序列的PCR扩增 9

2.3.4 PCR扩增后产物测序 10

2.4 数据处理 10

2.4.1 DNA提取，PCR扩增以及DNA测序 10

2.4.2 样品物种确定 10

2.4.3 DNA条形码鉴定研究 13

2.4.4 系统进化树（NJ树）分析 18

第三章 结果与展望 24

3.1 ITS2序列鉴定方法 24

3.2 psbA-trnH序列鉴定方法 24

3.3 樱属植物鉴定体系 24

图3.1 樱属植物鉴定流程图 26

3.4 研究展望 27

3.4.1研究不足之处 27

3.4.2研究展望 27

3.5 总结 27

参考文献 28

致 谢 30

第一章 绪论

1.1 樱属植物概述以及研究现状

樱属（Cerasus Mill.）植物，是属于蔷薇科（ROSACEAE）的灌木或落叶乔木，樱属植物主要是分布于北半球的温和地区，在亚洲、欧洲以及北美洲均有物种分布记录。中国的西部以及西南部，日本和朝鲜均为樱属植物的主要分布地区。其中，中国有着世界上最为丰富的樱属植物种质资源，大约有种50余^[1]。确切的独立樱属的标准定义确立于1954年，Millerp.将原来的樱亚属Prunus Subgen.Cerasus从广义上的李属 Prunus中独立出来，命名为樱属Cerasus，此后樱属植物分类系统不断被完善。中国的樱属系统研究开始于陈嵘先生的《中国树木分类学》^[2]。现在，各植物分类学家对樱属植物的分类系统大致持有两种不同的观点，一是李属樱亚属的分类观点，二是独立的蔷薇科樱属的观点。本文章采用《中国植物志》中独立的蔷薇科樱属的观点进行论述。

樱属植物主要分为两大类，主要以观赏性为目的的樱花和主要以食用性为目的的樱桃。以食用性樱桃为例，中国的樱桃栽种历史具相关文献记载，已经有两千多年。在中国有着广泛的分布。而近现代引进的西洋樱桃，主要为欧洲甜樱桃和欧洲酸樱桃，则主要栽种于华东沿海地区。而观赏性用途的樱花，主要是山樱花（日本晚樱）和东京樱花（染井吉野）两种，在我国各大城市的庭院、道路、风景区都有种植。其中大连，青岛，武汉是我国主要种植观赏樱花的城市。

樱属植物除了上文提及的食用价值和观赏价值外，还具有一定的药用价值。樱花皮、木材中含有龙胆酸的5-葡萄糖甙和5-鼠李糖葡萄糖甙、樱桃甙；木材中含有d-儿茶素；茎、叶含槲皮素3-半乳糖甙；嫩叶中含有香豆素、反式一邻羟基桂皮酸葡萄糖甙、氰甙；种仁中含有脂肪油32%，主要含a-桐酸、谷甾醇，可以用于治疗、缓解咳嗽、发热等症状。

但由于樱属植物的药用价值尚未得到很好的开发利用，所以现在对于樱属植物鉴定还没有一个标准的行业规范，同时也没有一个相对成熟的鉴定体系。导致樱属植物在开发利用中没有一个有利的环境。因此，建立起一种快速有效并简便的樱属植物鉴定方法，能为樱属植物的开发利用提供一个良好的开发的环境。

1.2 DNA条形码技术

1.2.1 DNA条形码技术的概念

DNA条形码技术，是通过利用一段或者几段标准的、具有足够变异的、易扩增并且相对较短的DNA片段中的特异性和种间的多样性而创建的一种新的，基于分子生物学层面的物种身份识别系统。从而实现对物种的快速、自动、批量鉴定，并有望实现物种鉴定的专业化、自动化^[3]。该方法通过筛选和整合大量来自不同科、属和种的样品DNA信息，确定其中的通用条形码，建立所测物种的单一或全面的条形码数据库和鉴定平台。日后就可以通过生物信息学分析方法，分析比对物种的DNA 数据，从而建立起物种鉴定的体系。

1.2.2 DNA条形码技术的优点

DNA条形码技术的操作比起传统的鉴定方法，显得更加简便快捷，也比传统的鉴定技术更加准确客观。DNA条形码技术经过通过不断的发展，在物种鉴定方面有着广泛的、科学的应用。

DNA条形码技术优点总结如下：（1）DNA条形码技术基于分子层次对物种进行鉴定，不受物种形态，形状的干扰，并且利用成熟的聚合酶链式反应以及核酸测序技术，从而实验物种的快速，准确，便捷的鉴定^[4]。（2）DNA条形码技术鉴定不受植物生长阶段形态差异的约束，同种生物在不同的生长阶段中，有着相同的基因组，也不受植物加工后的影响，即使是一小块的生物组织就可以进行DNA条形码提取鉴定，从而归类至已知物种。（3）可以建立起一个数字和条形码的数据库，从而可以进行批量检测，达到快速检测的目的。也可对已鉴定的样品追根溯源，为药用植物质量检测提供方法。

随着分子生物学的不断发展，DNA条形码的鉴定技术被广泛的运用在各个领域的实践操作中，有希望实现对目前人类已知的一千万种真核生物进行成功鉴定^[5]。

1.2.3 中药材鉴定中DNA条形码技术应用概述

传统的中药鉴定技术，需要鉴定者有丰富的中药理论知识以及实践经验，而且有非常强的主观性，在这种情况下，中药的鉴定受到极大的制约。随着分子生物学的发展，目前，在各种植物鉴定方法中，使用DNA条形码的鉴定方法，无疑是最为准确、简便和快速的一种鉴定方法。DNA 条形码鉴定技术，是利用基因组中的一段公认标准的、易扩增的且相对较短的 DNA 序列，来进行物种鉴定的一种分子生物学技术^[6]，该DNA片段从分子的角度上，具有物种的多样性及特异性。应用该技术进行物种鉴定，可以不受生物的个体发育状况以及其形态特征的限制。从而实现物种鉴定的自动化和标准化，克服了对于主观经验的过度依赖，因而，该技术被大量用于中药材品种鉴定、遗传多样性分析、指纹图谱构建等方面的研究^[7-8]。在植物鉴定，特别是中药材鉴定中，DNA条形码鉴定相比于传统中药鉴定方法有着革命性的进步^[9]。即使是从未接触过中药材鉴定的非专业人士，也可以利用该项技术鉴定天然药材。为天然药用植物的发展应用提供更为便利的条件。本实验采用核糖体序列^[10]ITS2和叶绿体序列^[11]psbA-trsH两条序列对樱属植物进行种源鉴定。

1.2.4 ITS2序列和psbA-trnH序列简介

有研究报道曾提出，将ITS2序列作为绿色植物鉴定的通用片段^[12]，认为他在种的水平上分辨较高以及引物通用性良好。近年来，ITS2序列被广泛用于中药鉴定。故本实验采用以ITS2序列为主进行研究分析。

psbA-trnH序列的扩增成功率较高，并且其引物通用性良好，因此在物种识别比较上有良好表现^[13]，但其自身有着一定的缺点，比如普遍的存在插入和缺失现象^[14]，导致DNA序列间存在较大的差异，故本实验以 psbA-trnH序列为辅进行研究分析。

1.3 研究的内容、目标及意义

本研究以武汉、南京、上海的观赏樱属植物（樱花）以及四川的食用樱属植物（樱桃）的51个样品为研究材料，利用DNA条形码中ITS2和psbA-trnH两条序列片段对其进行测序分析，鉴定其详细的物种信息，通过分析其种内以及种间遗传距离，以及构建樱属与其他属（如李属、杏属等）间，以及樱属植物属内种间的系统进化树，建立起简单的樱属植物DNA数字和条形码数据库，建立基础的樱属植物鉴定体系。

本研究目标是建立樱属植物的鉴定系统，为樱属植物的快速、准确、批量鉴定提供方法依据。同时收集存储樱属植物DNA条形码鉴定信息，为日后樱属植物产品开发时，药用材料提供追根溯源。

本研究的意义是为樱属植物鉴定提供分子生物学方法基础，为樱属植物鉴定数据库的建立打下基础。同时也为日后樱属植物的开发利用提供有利的研究环境。

第二章 樱属植物DNA条形码实验研究

2.1实验原理

2.1.1 DNA条形码原理

脱氧核糖核酸（DNA）是一种生物遗传信息载体，生物多样性是由不同的遗传基础决定的^[15]每一物种都有其独特的脱氧核糖核酸序列，在基因序列中，每个碱基位点都有A、T、C、G四种可能选择的情况，不同物种的DNA序列，通过四个碱基的不同排列组合，形成物种之间各自独特的DNA条形码片段。随着分子生物学的不断发展，以及物种的基因库测定，通过建立起了不同物种的DNA条形码数据库^[16]，从而可以方便的鉴定已知物种，也可以用于发现新的物种，以及发现已知物种的新的变异。

2.1.2 植物总DNA提取方法

总DNA，主要指物种基因组DNA（genomic DNA），即植物细胞中细胞核内的染色体DNA分子。植物DNA提取一般采用CTAB法和SDS法^[17-18]。

CTAB法，是使用阳离子去污剂CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），能够溶解植物细胞的细胞膜，并且能与核酸形成复合物。所形成的复合物，可溶于高盐溶液中。通过有机溶剂抽提复合物，去除其中含有的杂质，如蛋白、多糖、酚类等后，加入乙醇溶液，使得复合物溶解度降低，沉淀析出，即可使核酸分离出来。

SDS法，是使用阴离子去垢剂SDS（十二烷基硫酸钠），在高温（55～65℃）条件下能裂解植物细胞，使细胞内的染色体中的蛋白变性，从而释放出核酸；提高盐(KAc或NH₄Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖等杂质沉淀，通过离心法来除去沉淀；上清液中的DNA可以在用氯仿/异戊醇抽提除蛋白质后，用乙醇或异丙醇沉淀水相中的DNA。

2.1.3 DNA检测方法

本实验采用的DNA检测方法是凝胶半定量法。方法的原理是，由于DNA分子在高于等电点的缓冲溶液中带负电荷。利用这一性质，将DNA置于电场中，DNA分子受正电荷吸引，向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比，故可以将不同长度片段的DNA分子分离开，对所测的PCR扩增后序列进行纯化。

2.1.4 PCR原理

PCR扩增过程，是由三个基本反应步骤构成的：变性--退火--延伸；一是总DNA的变性：总DNA经过加热至90~95℃一段时间后，总DNA双链分子结构或经PCR扩增形成的双链DNA发生解离形成单链，该单链DNA与引物结合，为下轮反应扩增作准备；二是总DNA与引物的退火：总DNA变性解旋成单链后，温度冷却降至50~60℃，总DNA的单链与引物的序列配对结合；三是引物的延伸：DNA模板--引物结合物于70~75℃在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，这样就可获得更多的“半保留复制链”。而且这种PCR扩增形成的新链，在下一循环阶段，还可成为下次循环的DNA模板，进行下一个扩增。每完成一个循环大概需2～4分钟，所以2～3小时就能将待扩目的DNA序列扩增至几百万倍。

2.1.5 测序原理

Sanger双脱氧链终止法：合成的寡核苷酸引物同单链DNA模版退火，设立4种不同的测序反应，每一种反应中都含有DNA聚合酶和4种正常的dNTP及少量的由3’-H取代了普通脱氧核糖3’-OH的2’,3’-ddNTP。如果ddNTP掺入到延伸的DNA链中，由于缺少进一步形成5’-3’磷酸二脂键的3’-羟基，DNA链的进一步延伸被终止。由于脱氧核苷酸的比例大于双脱氧核苷酸，DNA合成反应可以继续进行，并最终产生大量的不同片段长度的寡聚核苷酸。将4种反应产生的寡核苷酸加到测序相邻的泳道上，就可以从凝胶的底部到顶部按5’-3’方向读出新合成链的序列。

2.2 实验材料

2.2.1樱属植物采集，保存

本实验收集51份样品，包括湖北省武汉市，40份樱花样品；湖北省黄冈市，1份樱花样品；江苏省南京市，2份樱花样品；上海市，4份樱花样品；四川省什邡市，4份樱桃样品。样品采集信息见表2.1。所收集的样品置于变色硅胶中干燥保存备用^[19]。

表2.1 样品采集信息

2.2.2 仪器与试剂