1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

甲状腺素片体外溶出行为一致性评价

一、研究背景

2012年初，国务院公布了《关于印发国家药品安全”十二五规划”的通知》，提出了要全面提高仿制药质量，正式拉开了我国仿制药一致性评价的序幕。2016年2月6日，国务院办公厅公布了《国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》，就开展一致性评价工作提出了一系列意见。

原研药是指原创性新药，亦可指全球首次上市的新药。仿制药是指以原研药作为参考，仿制生产出的药品。与原研药相比，仿制药的研究投资更少，研究周期更短，使其相比原研药价格更低，某些仿制药可能比原研药有更好的疗效。但是因为受到我国当时的法规和管理条件的限制，使我国仿制药与原研药的质量和疗效仍然有一定的差异，产生质量差异的主要原因有：第一，原料药有多晶型，某些药物的疗效与晶型有密切的联系，结晶水数量也会影响溶解度和稳定性，第二：药物辅料的组成和质量直接影响药物的释放和吸收，同时对疗效也有显著的影响^[4]，第三：不同厂家的技术差异也是导致仿制药与原研药质量差距的原因。质量差异主要体现在体外溶出度和体内生物等效性指标上，这两项指标是反应药品等效的重要指标^[2]。体外多条溶出曲线（一般采用四条曲线表达）是口服固体制剂内在品质体现在外在的一种”表象”，当仿制药4条体外溶出曲线与原研药相一致时体内生物利用度一致的概率可以大大提高^[5]。因此，体外溶出度试验将作为仿制药质量与疗效一致性评价的主要实验手段。

二、基本信息

1、甲状腺片（来自百度百科）

甲状腺素是人体内最重要的激素之一，甲状腺功能低下的人，需要服用药物补充甲状腺素以维持体内正常的生理功能。目前市场上有关补充甲状腺素的药物有两种，一是甲状腺片，用猪的甲状腺粉末制成，为甲状腺激素药。本品主要成份甲状腺激素包括甲状腺素（T4）和三碘甲状腺原氨酸（T3）两种。有促进分解代谢(升热作用）和合成 代谢的作用，对人体正常代谢及生长发育有重要影响，对婴幼儿中枢神经的发育甚为重要。甲状腺激素的基本作用是诱导新生蛋白质包括特殊酶系的合成，调节蛋白质、碳水化合物和脂肪三大物质，以及水、盐和维生素的代谢。由于甲状腺激素诱导细胞膜Na -K 泵的合成并增强其活力，使能量代谢增强。甲状腺激素（主要是T3）与核内特异性受体相结合，后者发生构型变化，形成二聚体，激活的受体与DNA上特异的序列，甲状腺激素应答元件相结合，从而调控基因（甲状腺激素的靶基因）的转录和表达，促进新的蛋白质（主要为酶）的合成。

2、左甲状腺素钠片（来自百度百科）

左甲状腺素钠是化学合成药物，商品名为优甲乐，其化学名称为4-氧-(4-羟基-3，5-二碘苯基)-3，5-二碘-L-酪氨酸钠，由德国默克公司研发生产，其结构式为：

其药理作用为：本品中所含有的合成左甲状腺素与甲状腺自然分泌的甲状腺素相同。它与内源性激素一样，在外周器官中被转化为T3，然后通过与T3受体结合发挥其特定作用。人体不能够区分内源性或外源性的左甲状腺素。
　　其毒理作用为：左甲状腺素有非常轻微的急性毒性。通过不同种属的动物（大鼠、狗）的慢性毒性研究发现，给予大鼠高剂量左甲状腺素钠时，会出现肝病迹象，自发性肾病的发生率升高，以及器官重量会发生改变。仅有极少的无效数量的甲状腺激素会通过胎盘。已有充分的人体试验数据表明，在怀孕的不同时期应用左甲状腺素，对胎儿没有任何的毒性效应，也不会引发畸形。没有报道表明本品会损害男性或女性的生育力，也没有任何迹象表明生育力的损伤与本品有关。尚无本品致突变的信息。到目前为止，没有任何迹象表明甲状腺激素会引起基因组改变从而对后代产生损害。关于左甲状腺素的致癌作用，尚未进行过长期的动物试验。

3、质量标准

	ChP[19]	USP[20]
崩解时限	1h	15min
微生物限度	l g 供试品中需氧菌总数不得超过10000cfu，霉菌和酵母菌总数不得lOOcfu，不得检出大肠埃希菌。10 g供试品中不得检出沙门菌。	片剂满足沙门氏菌种和大肠杆菌不存在的试验要求
性状	为糖衣片或薄膜衣片，除去包衣后显淡黄色至淡棕色	无
鉴别	取本品适量，除去包衣后，研细，称取适量(约相当于甲状腺粉0. 2 g )，加水20ml，振摇，置离心管中，每分钟3000转，离心3#12316;5 分钟，弃去上清液，加氢氧化钠试液5ml，在水浴中加热1 0分钟，放冷，加稀硫酸适量使溶液析出沉淀（p H 值约为4 ) ;以每分钟3500转，离心1 0分钟，分取沉淀约1 /3，加稀乙醇2 m l与盐酸1 滴，摇匀，加10% 亚硝酸钠溶液2#12316;3 滴，煮沸，黄色加深；放冷，加过量的浓氨溶液，黄色即变成橙红色。	无
含量均匀度	取本品1 片，研细，照甲状腺粉含量测定项下的方法，自”置预先充有氮气的带螺帽试管中”起，依法测定左甲状腺素和碘塞罗宁含量，除限度为士 20%外，应符合规定（通则0941)	极谱法

4、国内外研究情况

关于甲状腺片的研究，上海长城药业有限公司拥有一种关于甲状腺片及其制备方法的发明专利，其中包括甲状腺片的处方设计，制备工艺，提供了一种含量均匀的甲状腺片和其制备方法^[23]。另外，有关甲状腺素和左甲状腺素钠的含量测定，在国内外有较多研究，有固相萃取-高效液相色谱法，化学发光免疫法，反相高效液相色谱法等测定左甲状腺素钠的含量，高效液相色谱-串联质谱法，固相试管酶联免疫法等测定游离甲状腺素的含量^[24-26]，也有国外专家如Dimple Pabla, Fatemeh Akhlaghi, Aftab Ahmed and Hossein Zia建立了电感耦合等离子质谱法测定左甲状腺素钠^[16]，J.W. Collier , R.B. Shahb, A.R. Bryantb,M.J. Habiba, M.A. Khanb, P.J. Faustinob建立了高效液相色谱法测定左甲状腺素钠溶出样品^[17]。

三、研究方法

1、方法建立

（1）溶出介质的选择

甲状腺片是多组分生化药，是用猪甲状腺粉末制剂而成，其中成分种类多，包括甲状腺素（T4）、三碘甲腺原氨酸（T3）、二碘酪氨酸(T2)、一碘酪氨酸(T1)和多种蛋白质等，但是甲状腺素（T4）和三碘甲腺原氨酸（T3）含量极低，同时甲状腺素在其中的存在形式与一般药物不同，它以蛋白结合态形式存在，因此需要酶解才能使其中有效成分分解下来，所以溶出介质选用人工肠液或人工胃液，以模拟人体对药物消化吸收的情况，只有测定药物的溶出介质和实验条件与体内胃肠道环境越相似，才越能反应药物的体内释放吸收情况，建立良好的体内外相关性^[23]。

（2）溶出方法与取样时间点

取参比制剂和仿制制剂各12片，按照《中国药典》2015年版（四部）中溶出度与释放度中第二法（桨法），溶出温度37摄氏度，转速50r/min，测定药品在人工胃液或人工肠液中的溶出曲线，取样时间点为5min，10min，15min，20min，30min，45min，60min。

（3）溶出液检测方法

本品API标示量较低，根据ChP及USP规定：本品按甲状腺粉的标示量计算，每1mg含左甲状腺素（T4）与碘塞罗宁(T3)应分别为：0.52～0.64μg、0.13～0.15μg。本品（规格:40mg）每片含T4：20.8～25.6μg、T3：5.2～6.0μg，以溶出介质100～1000ml,溶出曲线测定最低点溶出度10%估算，灵敏度(定量限应达到：T4：0.002～0.02μg/ml、T3：0.0005～0.005μg/ml)。这对溶出度测试技术灵敏度提出了非常高的要求，因此测定应该选用专属性强、灵敏度高的检测方法。

电化学发光免疫是电化学发光和免疫测定相结合的一种方法，反应底物有两种：三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]² 络合物、三丙胺(Tripropylamine，TPA)，它的原理是：电化学反应过程：在工作电极上(阳极)加一定的电压能量作用下，二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]² 释放电子发生氧化反应而成为三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³ ，同时，电极表面的TPA也释放电子发生氧化反应而成为阳离子自由基TPA ，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA#183;，这样，在反应体系中就存在具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³ 和具有强还原性的三丙胺自由基TPA#183;。化学发光过程：具有强氧化性的三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³ 和具有强还原性的三丙胺自由基TPA#183;发生氧化还原反应，结果使三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³ 还原成激发态的二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]² ，其能量来源于三价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]³ 与三丙胺自由基TPA#183;之间的电势差，激发态[Ru(bpy)₃]³ 以荧光机制衰变并以释放出一个波长为 62Onm 光子的方式释放能量，而成为基态的[Ru(bpy)₃]² 。循环过程：上述化学发光过程后，反应体系中仍存在二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]² 和三丙胺(TPA)，使得电极表面的电化学反应和化学发光过程可以继续进行，这样，整个反应过程可以循环进行。通过上述的循环过程，测定信号不断的放大，从而使检测灵敏度大大提高，所以ECL测定具有高灵敏的特点。因为电化学发光过程产生的光信号的强度与二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]² 的浓度成线性关系，所以测定甲状腺片溶出液中甲状腺素含量时，将二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]² 与免疫反应体系中的一种物质结合，经免疫反应、分离后，检测免疫反应体系中剩余二价的三氯联吡啶钌[Ru(bpy)₃]^{2 ，}经上述过程后所发出的光，即可得知甲状腺素的浓度。

LC-MS联用技术是以液相色谱技术作为分离手段，以质谱作为检测器的综合技术手段。它能够将液相色谱的强分离能力与质谱的高灵敏度与高鉴别性结合起来，得到样品的含量和分子结构信息等。串联质谱（MS/MS）是将一个质量选择的操作接到另一个质量选择的后面，在单极质谱给出化合物的分子量信息后，对准分子离子进行多极裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量等^[11-12]。应用LC/MS/MS方法测定甲状腺片溶出液中的甲状腺素含量，可以满足专属性和灵敏度的要求，但是使用时注意易出现流速不兼容、流动相不兼容的问题。

2、方法学验证

（1）专属性实验：专属性是指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能正确测出被测物的特性。

（2）线性与范围：本实验中在设计范围内进行实验，取对照品配成线性考察对照溶液，按照上述方法进行实验，验证在此范围内线性是否良好。

（3）重复性实验：设计3个不同浓度（80%、100%和120%浓度），每个浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定，并计算RSD。

（4）回收率实验：目的主要是验证方法得可靠性。它是测定量和实际量的比值，一般在95%~105%之间。称取对照品与辅料按处方比例混合,80%,100%,120%各三份,测得值/加入值=回收率。

（5）中间精密度实验：与重复性不同的时间，不同的试验人员，用不同的溶出仪进行实验。

（6）耐用性实验：改变测定条件，研究其对方法的影响，进行方法学验证。

3、稳定性考察

（1）溶出介质中的稳定性

测定甲状腺片在溶出介质中的稳定性，取甲状腺片原料制备成一定浓度的溶液，在室温下放置并于0,2,4,6,12h进行测定。

（2）影响因素实验

①强光照射实验

将甲状腺片除去内包装，置于培养皿中，铺成5mm左右厚度均匀的薄层，在4500lx光照下放置10天，分别于第5、10天取样检测，并于第0天结果进行比较。

②高温实验

将甲状腺片除去内包装，在60℃恒温箱内放置10天，于第5、10天取样检测，并与第0天结果比较。

③高湿度实验

将甲状腺片置于恒湿密闭容器中，在25℃相对湿度为90%#177;5%条件下放置10天，分别于第5、10天取样检测，并于第0天结果进行比较。

（3）加速实验

取甲状腺片上市包装的3批样品，在温度40℃#177;2℃、相对湿度75%#177;5%的条件下，进行6个月试验。在试验的第1个月、2个月、3个月、6个月分别取样检测，与0个月结果比较。

（4）长期实验

取甲状腺片上市包装的3批样品，在温度为25℃#177;2℃、相对湿度60%#177;10%条件下放置12个月，或在温度30℃#177;2℃、相对湿度65%#177;5%条件下放置12个月，每3个月取样一次，分别于0个月、3个月、6个月、9个月、12个月取样检测，将结果与0个月比较。

四、计算方法

1、溶出曲线的绘制

在溶出曲线的测定中有补液和不补液两种方式，但必须保证每次抽取体积的国定性。补液的累积校正公式为：

各时间点校正后的累积溶出量（%）：

不补液时间点校正后的累积溶出量（%）：

计算后绘制出溶出曲线，

2、溶出曲线相似性评价

进行仿制药一致性评价，对仿制药和原研药的溶出曲线进行相似性评价。溶出曲线相似性评价最常用的方法是美国FDA颁布的f₂因子比较法，具体计算公式为：

其中n为取样时间点的个数，T_i与R_i分别为各取样时间点仿制制剂与参比制剂的平均溶出率^[14]。f₂因子在0#8212;100之间，f₂越大则仿制制剂与原研制剂相似性越大，另外由于批间差异的存在，一般认为如果仿制药与参比制剂的溶出曲线差异不大于参比制剂间的溶出曲线差异，则可以认为仿制制剂与参比制剂具有相似性。因此，当f₂因子不小于50的时候两者相似。在计算fshy;₂因子时选取的时间点间隔无需相等，但两制剂所选时间点必须一致，且时间点不应少于3个，在溶出率85%以上的时间点不应多于一个，否则会使f₂因子变大^[14-15]。

五、总结

仿制药一致性评价是关于我国国计民生的大事，它能够显著提高我国制药行业的研发、生产能力，对于提高我国药品质量与安全性，节约医药费用，提升我国制药行业发展质量，促进医药产业升级和结构调整，增加国际竞争力有十分重要的意义。

甲状腺素片是首批被列入一致性评价目录的基药品种之一，目前国内外尚未见对甲状腺片的体外溶出行为评价方面的报道，本课题研究具有一定的创新性，对此类药物的体外释放行为的研究具有一定的指导意义。

参考文献：

1. 刘海静，曹茂开，宋愿智，对”仿制药一致性评价工作”的几点认识和思考

2. 郁庆华，我国仿制药与原研药的一致性评价，上海医药2013年 第34卷 第5期（3月上）35~37

3. 黄浪，伍巧吉，谈原研药与仿制药的不同，北方药学2011年 第8卷 第8期 83~84

4. 胡欣，金鹏飞，仿制药与专利药临床疗效的技术思考，中国新药杂志2012年第21卷第6期,601~604

5. 牛剑钊，刘佳，李茂忠，杨昭鹏，李慧义，张启明，日本仿制药品质一致性再评价介绍及对我国的启示，中国药事2013年第27卷第4期,429~440

6. 沈素，比较甲状腺粉及其制剂中、美药典检查方法之异同，中国医院药学杂志2007年第27卷第4期,548~549

7. 张翠莲，魏晓晨，李大魁，梅丹，甲状腺片的质量比较，中国药品标准2006年第7卷第3期,73~76

8. 付志锋，魏伟，李翠芳，王振兴，电化学发光免疫传感技术在生物药物分析中的研究进展，中国科学，2011年第41卷第5期,773~784

9. 王芬，电化学发光及其在药物分析中的应用

10. 赵欣，陈国华，吴琼珠，滕海堂，郁婷婷，盐酸决奈达隆片仿制药与原研药的溶出度一致性评价，中国药房，2016年第27卷第30期,4278~4281

11. 尹显贵，液相色谱-质谱/串联质谱联用技术及其在药物分析中的应用，天津药学 2005年6月第17卷第3期，51~53

12. 李忠红，王玉，倪坤仪，LC-MSⁿ在药物分析中的应用，药物分析杂志，2004 24（3），341~344

13. 张启明，谢沐风，宁保明，庾莉菊，采用多条溶出曲线评价口服固体制剂的内在质量，中国医药工业杂志，2009，40（12）,946~955

14. 谢沐风，溶出曲线相似性的评价方法，中国医药工业杂志，2009,40（4）,308~311

15. 马玉楠，采用f₂因子法评价溶出曲线相似性需注意的问题，20070806

16. Dimple Pabla, Fatemeh Akhlaghi, Aftab Ahmed and Hossein Zia，Development and validation of an inductively coupled plasma mass spectrometry method for quantification of levothyroxine in dissolution studies，Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22: 993#8211;996

17. J.W. Collier , R.B. Shahb, A.R. Bryantb,M.J. Habiba, M.A. Khanb, P.J. Faustinob，Development and application of a validated HPLC method for the analysis of dissolution samples of levothyroxine sodium drug products，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 54 (2011) 433#8211;438

18. Ivana Kocic，Irena Homsek, Mirjana Dacevic, Jelena Parojcic, and Branislava Miljkovic3，An Investigation into the Influence of Experimental Conditions on In Vitro Drug Release from Immediate-Release Tablets of Levothyroxine Sodium and Its Relation to Oral Bioavailability，AAPS PharmSciTech, Vol. 12, No. 3, September 2011 (#2011)

19. 中国药典，2015版

20. 美国药典，USP38-NF33 S2

21. 日本药典，JP17

22. 胡昌勤，潘瑞雪，溶出度试验评价/预测固体口服药物生物等效性的研究进展，中国新药杂志，2014年第23卷第1期,44~51

23. 中国专利上海长城药业有限公司，一种甲状腺片及其制备方法，中国专利：CN:105168170A,2015-10-19

24. 沙玉红，钱霁翀，吕森迪，徐成银，郭智勇，固相萃取-高效液相色谱法测定人血清中左甲状腺素钠，分析试验室，2014年5月，第33卷第5期，589~591

25. 孙传良，应用反相高效液相色谱法检测左旋甲状腺素钠片含量及溶出度的研究，黑龙江医药，2007年第20卷第3期，191~193

26. 谷学英，刘志强，游离甲状腺素固相试管酶免测定方法建立的初步研究，中国计划生育学杂志，2005年第7期，427~429

27. 美国橙皮书

28.日本橙皮书

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

本课题要研究解决的问题是甲状腺素片溶出曲线的方法学建立与验证和仿制药与原研药溶出曲线的一致性评价。

1、建立测定甲状腺素片的溶出曲线的方法

（1）溶出介质的选择：选择人工胃液或人工肠液。