1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

文 献 综 述

1. crispr/cas9系统简介

1987年，日本课题组在k12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列^[1]，随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年科学家将其正式命名为clustered regularly interspaced short palindromic repeats （crispr），crispr的全称为成簇的、规律间隔的短回文重复序列，(crispr)/crispr-associated (cas)9 系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，zfn)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，talen)一样可用于各种复杂基因组的编辑。目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点indel 突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失。由于其突变效率高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

1. 要研究的问题：

如何使用crispr系统，以ssodn(单链供体寡核苷酸)为模板在哺乳动物的表达基因后定点敲入flag tag 标签，以及成功ki的效率评估及单克隆鉴定。