1. 研究目的与意义（文献综述）

近年来，随着农村产业结构的调整及一些湖泊资源、荒洼资源的开发利用，莲的生产得到了较快发展。莲作为中国重要的水生经济作物，一般可分为子莲、藕莲和花莲三类[1]，是具备观赏、食用、药用为一体的植物。莲全身皆是宝，藕和莲子能食用，在亚洲已经有超过7000年的食用历史。根茎、藕节、莲叶、花及种子的胚芽等都可入药[2]，它的芽，花，花药，雄蕊，果实，叶，茎，根茎和根已被用作草药治疗癌症，抑郁症，腹泻，心脏问题，高血压和失眠症等多种疾病[23、24]，这些在历年来的中药典籍中多有记载。莲花是我国十大名花之一，被多作城市列为市花例如澳门、济南，莲花与佛教密切相关，在佛教中它被用作象征和装饰性物质[3]。人们对莲的价值掘取从未停止过。

莲的繁殖过程却一直存在问题，莲原产亚洲热带和温带地区，中国早在周朝就有莲的栽培记载。莲的繁殖一般是种子繁殖和分藕繁殖，种子繁殖的方式对时间季节要求高，且莲藕为异花授粉，后代常长出现现状，商业价值较低，该方式一般只用于育种。为了保持亲本的优良性状和避免有性繁殖的分离现象，通常采用分藕繁殖[6]，但这种繁殖方式的繁殖系数很低，因此要探索新型的育种方式。

随着科学技术水平的提高，植物组培繁殖因材料来自单一的个体，遗传性状一致且繁殖系数大，能够迅速满足市场需求，是较理想的繁殖方式。植物组织培养技术是在细胞学、植物生理学、微生物无菌培养技术的基础上建立发展起来的，从1902年haberlandt首次进行离体细胞培养实验以来，经过艰难的发展，现已成为理论基础完备，实验手段先进，应用成效显著的生物科学技术的重要分支。因此探索莲植物组织培养再生体系对于莲的快速繁殖，在莲上开展分子水平研究[12]、培育新型莲品种等工作至关重要。

2. 研究的基本内容与方案

研究的基本内容

1. 对于莲的不同品种诱导愈伤组织的探讨。

   品种：白花建莲、红花建莲、建选17号、太空系列。

2. 对于同一品种莲的不同器官或生长方式诱导愈伤组织的探讨。

   取材部位：开花8-12天莲子、S4时期的叶片、培养15-20天的无菌苗取其叶、柄、轴。

3. 对于同一外植体不同激素配比对诱导愈伤组织的探讨。

4. 对于产生的愈伤组织防褐化的研究。

   目标

   建立莲稳定、高效的愈伤组织诱导体系即：

1. 探索出最适合进行莲植物组织培养的外植体。

2. 探索最适合进行莲植物组织培养的激素配比。

3. 探索减少莲植物组织培养愈伤组织褐化的培养基激素配比。

   材料与方法

   流程图：

   2.1 实验材料

   试剂：MS培养基，95%乙醇，75%乙醇，2%次氯酸钠，盐酸，氢氧化钠（1mol/L调pH），无菌水，植物激素（2,4-D， NAA，TDZ，ZT，BA，GA）

   器材：容量瓶、锥形瓶、烧杯、试管、酸度计、封口膜、高压锅灭菌锅、蒸馏水器，超净工作台，灯管（紫外和白炽灯），培养架，酒精灯，脱脂棉，镊子，剪刀，手术刀，试管架，培养皿，培养瓶。

   植物来源及处理方式：中科院武汉植物园所培育出的莲选用白花建莲、红花建莲、建选17号、太空系列四个品种，分别在自然条件下进行育种后，取开花后8-12天莲子（莲子直径见表1）在超净工作台上去皮用75%乙醇浸泡1min，无菌水漂洗一次后用2%次氯酸钠浸泡15min最后再用无菌水漂洗五次，用无菌滤纸吸干水分[17]，每颗莲子分割成4-8份为外植体，同样取上述品种的成熟莲子同样进行上述灭菌处理后取莲心3个一组种植于同一无菌培养瓶中进行无菌苗培养，培养15-20天后取长势良好的无菌苗在超净工作台进行分离为大小合适（1cm*1cm）叶、柄、轴分别作为植物组织培养外植体，所有操作均为无菌操作。

   2.2实验方法

   2.2.1培养基本条件

   本试验主要进行无菌苗培养15-20天后产生外植体及开花8-12天莲子作为外植体以及少量处于S4时期的叶片进行组织培养，植物组织培养采用的基础培养基为MS培养基[5]在其中添加一系列如下所示植物激素及其他营养物质等后调节pH为5.6进行高压蒸汽灭菌121℃灭菌20min，暗处理3天后,在2000-2500lx照射下保持光照时间为16h/d，25℃恒温培养，培养基两周更换一次。

   2.2.2莲子植物组织培养

   用于植物组织培养激素配比分别在含有以下组合情况下进行培养NAA 7.45mg/L 、TDZ 0.11mg/L（见表2编号1））[10]；还添加30g/L蔗糖、8%琼脂于MS培养基，分别取4-8份外植体接种到培养皿上。接种后每隔2天观察一次，在培养两周后对不同品种比愈伤组织诱导率、褐化情况进行统计比较。

1. 表2莲植物组织培养激素配比

2.2.3无菌苗组织培养

用于无菌苗培养激素配比为NAA 0.5mg/L、6-BA 2.5mg/L还添加30g/L蔗糖、5%植物凝胶和3%琼脂于MS培养基，每个培养瓶中放入3个消毒干净莲心同样在2000-2500lx照射下保持保持光照时间为16h/d，25℃恒温培养，培养基两周更换一次，培养15-20天后取长势良好的无菌苗在超净工作台分离为大小合适（1cm*1cm）叶、柄、轴分别作为植物组织培养外植体按照上述莲子培养激素浓度配比接种于培养皿上，每隔2天观察一次，在培养两周后观察不同部位愈伤组织诱导情况并记录。

2.2.5取莲叶片组织培养

取建选十七号和红花建莲处于S3（未展开）和S4时期的叶片（开始展开未完全展开）用2%NaOCl冲洗10min后用无菌水洗三遍之后用于植物组织培养，激素配比为NAA 7.45mg/L 、TDZ 0.11mg/L，还添加30g/L蔗糖、8%琼脂于MS培养基，在2000-2500lx照射下保持保持光照时间为16h/d，25℃恒温培养，培养基两周更换一次，每隔2天观察一次，观察愈伤组织诱导情况并记录。

2.2.4愈伤组织防止褐化处理

取培养15-20天生长良好的未褐化愈伤组织按照以下激素配比组合情况下进行培养NAA 7.45mg/L 、TDZ 0.11mg/L和NAA 3mg/L 、TDZ 0.11mg/L和NAA 3mg/L 、TDZ 0.11mg/L、5.6mg/LVC和NAA 1.1mg/L TDZ 0.11mg/L 活性炭 1000mg/L（全部继续褐化舍去该激素配比）（具体同样见表2编号1-4）更换培养基进行培养，接种后每隔2天观察一次，在培养1-2周不同激素配比愈伤组织褐化情况进行统计。

3. 研究计划与安排

1. 1-3 周：查阅文献资料，拟定实验计划，完成开题报告。

2. 4-7 周：愈伤组织培养（主要实验内容暂定三种同步进行）

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   4. 参考文献（12篇以上）

   [1] 郭宏波.莲属（nelumbo）的资源分类[d].武汉：华中农业大学2003.

   [2]zhao, y.w.: aquatic vegetables in china. - china agriculture press, beijing 1999.

   [3]suvatabandhu, k., 1958. on nymphaeaceae of thailand. nat. hist. bull. 17, 11–15.

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