摘 要

作为酪氨酸激酶（RTK）信号通路的重要成员，成纤维细胞生长因子（FGF）信号通路在乳腺中的研究由来已久，但其在上皮微环境中的作用研究较少。乳腺成纤维细胞是乳腺上皮细胞微环境中的重要成员，其FGF信号通路的研究对揭示微环境调控乳腺发育及乳腺癌的发生有很重要的意义。

本课题利用Cre-loxP系统及CRISPR-Cas9系统来构建相关基因的敲除和过表达模型，并利用实时荧光定量PCR以及免疫组化染色等技术，进一步探究了乳腺成纤维细胞中FGF信号通路对乳腺发育的影响。

研究结果表明：在正常乳腺成纤维细胞中，主要表达FGFR1，FGFR2，几乎不表达FGFR3和FGFR4；当乳腺成纤维细胞中FGFR1被敲除时，乳腺发育出现延迟现象，但当FGFR1，FGFR2被双敲除时，小鼠乳腺生长速度差别不大，且分枝更粗；为探究FGFR过表达对乳腺发育的影响，本课题成功构建FGFR1过表达载体，可以在体外提高FGFR1表达效率，同时FGF信号通路的下游靶基因Etv5发生上调。

关键词：乳腺；细胞微环境；乳腺成纤维细胞； FGF信号通路

Abstract

As an important member of receptor protein tyrosine kinase (RTK) signaling pathway, fibroblast growth factor (FGF) signaling pathway has been studied in mammary gland for a long time. However, the role in the epithelial microenvironment has been rarely studied. As an important member of the mammary epithelial microenvironment, the study of FGF signaling pathway in fibroblasts plays a very important role understanding relationship between microenvironment and epithelium in organogenesis and carcinogenesis of mammary gland.

In this study, the Cre-loxP system and CRISPR-Cas9 system were used to construct the Loss-of-fuction and Gain-of-function model of related genes.The real-time fluorescence quantitative PCR and immunohistochemical staining were used to further explore the influence of FGF signaling pathway in fibroblasts on different stages of mammary gland development.

I found that : FGFR1 and FGFR2 were mainly expressed in fibroblasts, while FGFR3 and FGFR4 were hardly expressed. When FGFR1 was knocked out in fibroblasts, mammary gland development was delayed, but when FGFR1 and FGFR2 were double-knocked out, there was no significant difference in the growth rate of mammary gland, and the branches were thicker. In order to explore the effect of FGFR overexpression on breast development, this study successfully constructed FGFR1 overexpression vector, which can improve the expression efficiency of FGFR1 in vitro, and the downstream target gene Etv5 of FGF signaling pathway is up-regulated.

Key words: Mammary gland；Microenvironment；Fibroblast；FGF signaling

目 录

第 1 章 绪 论 1

1.1乳腺的发育 1

1.1.1胚胎期的乳腺发育 1

1.1.2青春期的乳腺发育 2

1.1.3成熟期的乳腺发育 2

1.2乳腺上皮细胞微环境 3

1.2.1 乳腺基质的组成 3

1.2.2 乳腺成纤维细胞 3

1.3 FGF信号通路 3

1.3.1 RTK信号通路 3

1.3.2 FGF信号通路的作用机制及在乳腺中的研究现状 4

1.3.3 FGF信号通路在乳腺中的研究现状 4

1.4 Cre-loxP重组系统 4

1.4.1 Cre-loxP重组系统作用原理 4

1.4.2 Cre-loxP重组系统的应用 5

1.5 研究目标、内容及意义 6

1.5.1 研究目标 6

1.5.2 研究内容 6

1.5.3 研究意义 6

第 2 章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1小鼠 7

2.1.2主要试剂 7

2.1.3主要仪器 8

2.2 实验方法 8

2.2.1小鼠基因型鉴定 8

2.2.2 乳腺成纤维细胞的分离、培养 9

2.2.3 质粒转染及病毒感染 10

2.2.4 流式细胞荧光分析及分选 10

2.2.5 RNA提取、反转录、实时荧光定量PCR 10

2.2.6 乳腺切片制备及Carmine染色 12

2.2.7 体外重组载体的构建 12

2.2.8 数据分析 13

第3章 乳腺成纤维细胞中FGFR的表达 14

3.1 前言 14

3.2 研究目的及思路 14

3.3 实验结果 15

3.3.1 qPCR检测FGFR的表达情况 15

3.3.2 小结与讨论 16

第4章 FGFR敲除对乳腺发育的影响 17

4.1 前言 17

4.2研究目的及思路 17

4.3 实验结果 18

4.3.1 FGFR1/2敲除对乳腺发育的影响 18

4.3.2单敲表型与双敲表型的差异性探究 19

4.3.3 体内、外实验敲除情况分析 21

4.3.4小结与讨论 22

第5章 FGFR过表达对乳腺发育的影响 23

5.1 前言 23

5.2 研究目的及思路 23

5.3 实验结果 24

5.3.1 FGFR1过表达载体的构建 24

5.3.2 N₂A细胞中FGFR1过表达载体的功能性验证 25

5.3.3 成纤维细胞中FGFR1过表达载体的功能性验证 26

5.3.4 小结与讨论 27

第6章 结论及展望 28

参考文献 29

致 谢 31

第 1 章 绪 论

1.1乳腺的发育

乳腺作为雌性哺乳动物孕育后代的重要器官，对其发育机理的探究具有重要意义。乳腺作为皮肤衍生的上皮器官，具有多种基因技术操作等优势，是研究上皮器官发育和癌症发生的良好模型。在哺乳动物的乳腺发育过程中，不同发育时期具有不同的特点，主要包括三个阶段：胚胎期、青春期和成熟期。

1.1.1胚胎期的乳腺发育

图1.1 小鼠胚胎期乳腺发育图示.

(A) E11.5乳腺基板形成；(B) E13.5乳腺芽初步形成；(C) E15.5乳腺芽开始入侵脂肪垫；

(D) E18.5乳腺芽继续入侵脂肪垫，发育基本停滞.

在雌性小鼠乳腺发育胚胎期第10.5天（E10.5），可观察到乳腺的初级雏形线状结构形成；在E11.5天，线状结构向内凹陷形成乳腺基板^[1]（图1.1 A）；在E12.5~E13.5天，乳腺基板沿着前后轴发育形成乳腺芽^[2] （图1.1 B）；在E15.5天，上皮细胞开始侵入脂肪垫，形成乳腺芽（图1.1 C）；在E16.5~E18.5天时，乳腺芽逐渐形成空腔并继续入侵脂肪垫（图1.1 D）；在E18.5天之后，直到青春期之前，乳腺发育基本上处于停滞状态。

1.1.2青春期的乳腺发育

青春期的小鼠乳腺是观察上皮器官形态变化的良好模型^[3]，当小鼠进入青春期后，在荷尔蒙的调节下，乳腺上皮细胞在与乳腺间质相互作用，上皮的分枝状结构增多^[4,5]、乳腺上皮末端结构伸长、上皮细胞对脂肪垫的进一步侵袭^[6,7]等过程循环进行。在这个阶段中，乳腺上皮细胞逐渐形成管状网络结构（图1.2 A,B）。

在青春期时，乳腺的发育主要是由乳腺的特殊结构——末端芽(TEBs)来完成。TEB是由外侧一层帽子细胞（Cap Cells）和内侧多层体细胞（Body Cells）组成的一种棒状结构，一般出现在生长快速的导管顶端，是入侵脂肪垫的主要结构。TEBs内的增殖导致导管伸长，并且TEBs的劈裂导致导管分叉产生分支。出生后10-12周左右时，TEBs消失，上皮细胞在脂肪垫的生长达到极限，乳腺上皮细胞的生长随即进入静止期^[8]。

图1.2 小鼠出生后乳腺发育图示.

(A)青春期开始，乳腺分支开始扩张，TEB形成；(B)青春期发育，乳腺分支树继续扩张；(C)妊娠早期，脂肪垫消失，囊泡芽形成；(D)妊娠中期，导管分支增生，囊泡芽开始发育；(E)妊娠期，囊泡细胞迅速膨胀，占据脂肪垫绝大部分体积； (F)退化早期，分枝减少，乳腺进入退化阶段.

1.1.3成熟期的乳腺发育

在成熟期小鼠乳腺中，随着卵巢激素的分泌与每一个动情周期的发生，侧芽和囊泡芽逐渐开始发育^[9]。小鼠动情周期会持续4~5天，随着青春期后发育的继续，囊泡芽会细分形成基本的囊泡结构。

在小鼠怀孕期间，乳腺会经历进一步的发育和形态变化，为哺育后代做好准备。在起始阶段，导管分支开始增生、囊泡芽开始发育并且细胞外基质也会发生重塑（图1.2 C,D）；在泌乳阶段，分泌细胞开始合成和分泌大量的乳汁。随着乳汁量的增加，囊泡细胞会迅速膨胀，直至占据乳腺脂肪垫的大部分体积（图1.2 E）；而当小鼠幼仔出生后，无母乳喂养或小鼠幼仔开始断奶时，乳腺便进入退化的早期阶段，上皮细胞开始不可逆的级联退化重构和广泛的程序性细胞死亡，乳腺分支明显减少^[3] （图1.2 F）。最终，乳腺将会进入到怀孕前的状态，直到下一次母体怀孕。

1.2乳腺上皮细胞微环境

细胞微环境（cell microenvironment）是影响细胞生存的复杂环境，微环境的调控对于维持细胞正常增殖、定向分化等功能十分关键。

1.2.1 乳腺基质的组成

乳腺基质是构成乳腺上皮细胞微环境的主要成分，由多种基质细胞和细胞外基质(Extracellular matrix, ECM) 组成，在调节乳腺发育等方面有着重要作用 ^[10,11]。基质细胞主要包括乳腺成纤维细胞（Fibroblast）和脂肪细胞等支持细胞，内皮细胞以及免疫细胞^[12]。ECM主要包括胶原、透明质酸、纤维粘连蛋白、生长因子、细胞因子及代谢产物等。

1.2.2 乳腺成纤维细胞

作为乳腺基质功能的主要行使者，乳腺成纤维细胞调控着乳腺上皮分支形态的发生。一方面，乳腺成纤维细胞通过分泌成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）、胰岛素生长因子（Insulin-like growth factor，IGF）等多种生长因子与上皮细胞上相应受体结合，直接影响上皮细胞的存活、增殖和迁移等多种行为，从而促进上皮分支的形态发生 ^[13,14] 。另一方面，成纤维细胞可以分泌胶原、多糖、纤维连接蛋白等多种细胞外基质成分来调控细胞外基质的重构，从而间接影响上皮细胞的功能。

1.3 FGF信号通路

1.3.1 RTK信号通路

受体酪氨酸激酶信号通路是参与发育调控的重要通路之一，在多个器官发生中均发挥重要调节功能 ^[15,16] 。目前研究发现，在乳腺的形态发生过程中，与之相关的细胞增殖、迁移等多种功能活动中受到了RTK通路不可忽略的调控作用 ^[17]。

受体酪氨酸激酶（Receptor protein tyrosine kinase, RPTKs）是许多细胞因子、多肽生长因子和激素的高亲和性细胞表面受体。根据受体的同源配体和结构差异，可以分成胰岛素生长因子受体（Insulin-like growth factor receptor,IGFR）、表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）、成纤维细胞生长因子受体（Fibroblast growth factor receptor，FGFR）等。

1.3.2 FGF信号通路的作用机制及在乳腺中的研究现状

作为RTK通路的重要成员，FGF信号通路在乳腺发育中的研究展开已久^[18,19]。在小鼠中，FGF信号通路含有22个FGF配体，其中18个通过4个跨膜酪氨酸激酶受体(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4)起作用。每个FGF配体都能与一个或多个FGFR结合，使FGFR形成二聚体，进而在胞内进行磷酸化，激活下游通路，影响基因的表达和细胞的各种行为。

1.3.3 FGF信号通路在乳腺中的研究现状

FGF信号对乳腺的正常发育至关重要。例如，FGF10或其受体FGFR2的缺失导致胚胎发育过程中不能形成乳腺基板^[20]。上皮细胞中FGFR1或FGFR2的条件性缺失会导致分支形态发生中的短暂发育缺陷^[16]。虽然在30多年前，人们已经发现成纤维细胞在调节乳腺上皮反应中具有重要作用 ^[21]。然而，综合目前的研究，FGF信号通路的作用研究仅集中在乳腺上皮细胞中，对其在基质中的具体研究仍为空白。

1.4 Cre-loxP重组系统

1.4.1 Cre-loxP重组系统作用原理

Cre重组酶（Cyclization Recombination Enzyme）：是一类具有催化活性、能够特异性识别loxP位点的异构酶，最初在大肠杆菌噬菌体中被发现，由Cre基因进行编码。

LoxP（locus of X-overP 1）位点：由三部分组成，其中两个为13bp大小的反向重复序列，能够和Cre重组酶发生特异性识别；另一部分则是一段间隔区域，长度大小为8bp，这段区域决定了loxP位点的方向。

受loxP位点的位置及其在DNA链上方向的影响，Cre重组酶与loxP位点相互作存在差异性，其诱导重组的方式主要包括以下四种：

（1）存在2个loxP位点，它们位于同一条DNA链且同向，在与Cre重组酶特异性识别后，loxP位点间的序列被敲除（图1.3 A）；

（2）存在2个loxP位点，它们位于同一条DNA链且反向时，在与Cre重组酶特异性识别后，loxP位点间的序列发生翻转（图1.3 B）；

（3）存在2个loxP位点，它们位于不同的DNA链或染色体上，在与Cre重组酶特异性识别后，2条DNA链受诱导发生交换或染色体易位（图1.3 C）；

（4）存在4个loxP位点，它们位于2条DNA链或染色体上，在与Cre重组酶特异性识别后，loxP间的序列发生互换（图1.3 D）。

图1.3 Cre-loxP系统诱导的4种重组示意图.

(A)相同DNA链相同方向，loxP位点间序列被敲除；(B)相同DNA链相反方向，loxP位点间序列翻转.；(C)不同DNA链发生交换或易位； (D)不同DNA链上，loxP位点间序列互换.

1.4.2 Cre-loxP重组系统的应用

基于Cre-loxP重组系统，我们可以通过带有Cre基因的小鼠和带有loxP位点的小鼠杂交，从而得到目的基因重组的转基因小鼠。

“Cre小鼠”主要是利用显微注射技术，在小鼠体内，Cre重组酶受特定启动子控制进行表达；“floxed小鼠”则主要依赖于置换型载体的同源重组，确定选择标记基因后，在胚胎干细胞中向靶位点两侧引入2个loxP位点，最后注入假孕母鼠中。

由于转基因动物的培养周期较长且成本较高，在体外实验中，病毒依赖的基因重组系统更占据优势。采用病毒依赖的Cre-loxP重组系统的策略为：

（1） 通过转基因动物的杂交，获得一只带有Cre基因的小鼠和一只带有loxP位点的小鼠；

（2） 向“Cre小鼠”中转入带有loxP元件的病毒或向“floxed小鼠”中转入带有Cre重组酶元件的病毒，从而实现基因的重组

1.5 研究目标、内容及意义

1.5.1 研究目标

为进一步了解乳腺上皮微环境对乳腺发育的调控机制，该课题对小鼠乳腺上皮细胞中FGF信号通路展开研究，主要包括：探究小鼠乳腺成纤维细胞中FGFR的表达及其主要作用类型；探究乳腺成纤维细胞中FGFR缺失时对乳腺发育的影响，对FGFR1敲除的体内外实验出现的差异性进行分析，对比FGFR1缺失和FGFR1/2缺失后小鼠乳腺发育情况；探究乳腺成纤维细胞中FGFR过表达时对乳腺发育的影响。

1.5.2 研究内容

在研究小鼠成纤维细胞中FGFR的表达中，该课题通过体外培养乳腺成纤维细胞，提取其RNA进行qPCR检测，分析FGFR1-4及下游靶基因Etv4、Etv5、Mkp3的表达情况。

在研究乳腺成纤维细胞中FGFR缺失对乳腺发育的影响中，该课题通过小鼠基因工程技术得到FGFR1单独敲除和FGFR1/2均敲除的小鼠，在其发育不同时期观察乳腺生长情况，对FGFR1单独敲除和FGFR1/2均敲除的表型现象进行对比，并探究其差异性形成原因。

在研究乳腺成纤维细胞中FGFR过表达对乳腺发育的影响中，该课题通过CRISPR-dCas9技术构建FGFR家族中FGFR1过表达的载体，在mRNA水平对载体进行功能性验证并探究乳腺成纤维细胞中FGFR1过表达时发生的功能性变化。

1.5.3 研究意义

综合目前国内外的研究进展，FGF 信号通路的作用研究主要集中于乳腺上皮细胞中，在上皮微环境中的作用研究仍然较少。乳腺成纤维细胞是乳腺上皮细胞微环境中的重要成员，其FGF信号通路的研究对揭示微环境调控乳腺发育机制及乳腺癌的发生具有十分重要的意义。

第 2 章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1小鼠

主要小鼠基因型如表2.1所示：

表2.1 小鼠基因型种类