摘 要

Tau蛋白作为神经微管相关蛋白，与阿尔茨海默病的发生发展有着极大的关系。本文通过构建人tau融合蛋白表达质粒，引入突变后在大肠杆菌中诱导表达及纯化。以构建好的融合蛋白表达质粒为模版，通过反向PCR技术，在两个位点上引入突变，将PCR产物经消化纯化等操作后转入大肠杆菌BL21中，挑选阳性重组子。鉴定阳性重组子后，使用IPTG诱导表达，获得野生型Tau蛋白质及两种突变体。采用SDS-PAGE电泳染色鉴定及His Bind Resin纯化蛋白。研究结果表明已成功获得两种Tau蛋白片段突变体，纯化产率反映出纯化方法还有待改进。本文的特色在于利用分子生物学方法，构建两种不同长度的Tau蛋白片段突变体，利用亲和层析的方法获得纯化蛋白用于后续相关结构究及进行体外功能测试的研究。

关键词：Tau蛋白；片段突变体；大肠杆菌；分离纯化

Abstract

Tau protein, one of microtubule associated proteins, impacts greatly on development of Alzheimer disease. This paper constructs recombinant plasmid with Tau gene. Recombinant bacterial strain is induced and the expressed product is purified. Two mutations are brought into different sites of Tau gene respectively with recombinant plasmid as templates by reversed-PCR. With their digestion and purification, the products are transducted into E.coli BL21. Positive recombinant strains are selected and identified. Recombinant bacterial strains with recombinant plasmid containing gene mutation is induced with IPTG to harvest wild type and two different mutated proteins. All three types protein are identified with SDS-PAGE and purified with His Bind Resin. The result shows that preparations of all these three types proteins are successful and method of purification needs to be improved. The feature of this paper lies on construction of two different mutated proteins with molecular biology technology and purification of all three kinds proteins for later research about structures and test of functions in vitro.

Keywords: Tau protein；fragment-mutated segment；E. coli；purification

目 录

1.绪论 1

1.1阿尔茨海默病 1

1.1.1 阿尔茨海默病概念及具体表现 1

1.1.2 阿尔茨海默病的发病机制 1

1.1.3 阿尔茨海默病的早期诊断 4

1.1.4 阿尔茨海默病的治疗药物研究 5

1.2 Tau蛋白 9

1.2.1 Tau蛋白结构和功能 9

1.2.2 Tau蛋白的翻译后修饰 11

1.2.3以Tau蛋白为靶点的治疗方案 14

1.3 本研究的主要目标、研究内容和研究意义 16

2 实验材料和方法 18

2.1 实验材料 18

2.1.1 实验试剂和仪器 18

2.1.2 实验菌种 18

2.1.3 质粒载体 18

2.1.4 引物序列设计 18

2.1.5 培养基 18

2.2 实验方法 18

2.2.1 菌种保藏 18

2.2.2 克隆PCR—验证引物正确性 21

2.2.3 质粒提取 22

2.2.4 反向PCR—突变目的基因Tau 23

2.2.5 氯化钙法制备感受态细胞 24

2.2.6 PCR产物消化纯化 24

2.2.7 转化入感受态细胞 25

2.2.8 菌落PCR 25

2.2.9 蛋白质纯化 26

2.2.10 Bradford蛋白质定量实验 27

3.1 重组质粒的构建 28

3.1.1 基因克隆 29

3.1.2 提取pET-28a htau40载体质粒 29

3.1.3 pET-28a htau40质粒载体转化感受态细胞 29

3.1.4 反向PCR引入突变及产物的消化纯化 31

3.1.5 热激法转化反向PCR纯化后产物的转化单菌落筛选与测序 31

3.2 重组蛋白的诱导表达 32

3.3 重组Tau蛋白的诱导表达条件的优化 33

3.3.1 IPTG浓度诱导表达优化 33

3.3.2温度诱导表达优化 34

3.3.3诱导表达条件优化小结 35

3.4 小结 35

4 重组蛋白的纯化 36

4.1重组蛋白的纯化 36

4.1.1重组蛋白的纯化 36

4.1.2重组蛋白纯化的产率 39

4.2 分析 41

5 结论与展望 42

5.1 结论 42

5.2 展望 42

参考文献 43

致谢 46

1.绪论

1.1阿尔茨海默病

1.1.1 阿尔茨海默病概念及具体表现

1966年德国精神病学家和神经发病学家Alxheimer Alois首次发现并命名阿尔茨海默病。^[1]其作为一种退行性神经系统疾病，通常有三种类型，分别是：家族性早发型、家族性晚发型以及散发性晚发型。临床特征具体表现有以下几种：不可逆的进行性记忆减退、行为异常、社交障碍以及人格改变等。从病理学角度看，其特征则表现为：β-淀粉样蛋白聚集成老年斑、大脑皮质神经细胞内Tau蛋白过度磷酸化聚集形成神经元纤维缠结并造成微管损伤、神经元死亡或大量丢失、大脑皮质细胞减少、胶质增生、颗粒空泡变性、平野小体及脑血管改变、沟回增宽、脑萎缩、以及小动脉的血管淀粉样变性、新皮质的神经元密度下降。研究表明，阿尔茨海默病患者乙酰胆碱转移酶、乙酰胆碱的含量明显低于正常人，金属离子动态平衡失调，同时某些信号分子也将影响阿尔茨海默病的发病，诸如细胞内Ca² 浓度升高、蛋白激酶与磷酸酯酶的动态平衡失调。^[1-4]

1.1.2 阿尔茨海默病的发病机制

阿尔茨海默病的发病机制尚未完全探明，目前已知的可能因素可分为遗传因素和非遗传因素两大类，具体说来遗传因素包括：（1）载脂蛋白ε4基因；（2）早老素1和早老素2基因；（3）淀粉样前体蛋白基因；（4）Tau蛋白基因；（5）α2巨球蛋白基因；（6）其他阿尔茨海默病相关基因；非遗传因素则包括：（1）炎症和免疫学说；（2）自由基损伤假说；（3）胆碱能神经元假说；（4）氧化应激学说；（5）金属离子代谢紊乱学说；（6）；脑内胆固醇代谢紊乱学说（7）神经细胞凋亡学说；（8）病毒学说；（9）内分泌失调学说（雌激素水平下降与胰岛素抵抗）；（10）神经营养因子缺乏学说；（11）神经血管学说；（12）兴奋性氨基酸毒性学说；（13）细胞周期重返障碍学说；（14）褪黑素缺失学说；（15）轴突转运障碍学说；（16）突触受损学说；（17）microRNA等。^[1-3,5-6]阿尔茨海默病发病机制假说，见图1.1^[1]

图1.1 中英文缩写具体中文解释为：AchE为乙酰胆碱酯酶；Akt为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；APP为淀粉样前体蛋白；ApoE4为载脂蛋白E4基因；BACE为β淀粉样蛋白裂解酶；BuChE为丁酰胆碱酯酶；C99为C段99个氨基酸片段；CKD5为细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶5；ERK2为细胞外信号调节激酶；GSK-3为糖原合成激酶3；NMDA为N-甲基-D-天冬门氨酸；MG为小胶质细胞；P25为微管聚合促进蛋白；PKC为蛋白激酶C；PSEN1/2为早老素基因；ROS为氧自由基。^[1]