摘 要

微管系统是神经细胞骨架成分，可参与多种细胞功能。微管由微管蛋白及微管相关蛋白组成，Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白。正常脑中Tau蛋白的细胞功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管；与形成的微管结合，维持微管稳定性，降低微管蛋白分子的解离，并诱导微管成束。正常成熟脑中Tau蛋白分子含2～3个磷酸基。而阿尔茨海默症（老年痴呆症）患者脑的Tau蛋白则异常过度磷酸化，每分子Tau蛋白可含5～9个磷酸基，并丧失正常生物功能。

本实验基于优化和合成的tau蛋白序列，构建其质粒重组体并引入点突变，在大肠杆菌中进行表达，并对其表达温度，诱导时间进行优化，再利用亲和层析方式进行纯化，从而得到大量的纯化tau蛋白，进行下一步的体外功能测试。

关键词：htau；点突变；大肠杆菌BL21；蛋白纯化；二级结构

Abstract

The microtubule system is a component of nerve cells, which can be involved in a variety of cell functions. The microtubule is composed of tubulin and microtubule associated protein, Tau protein is the highest of microtubule associated protein. In the normal brain, cell function of Tau protein is binding tubulin and promote the polymerization of microtubule formation; and binding the formed microtubule, keep microtubule stability and reduce the degradation of the tubulin molecule and induced microtubule bundles. In normal mature brain, the Tau protein contains 2 ~ 3 phosphate groups.,but in the patients’ brain with Alzheimer's disease , Tau protein is over phosphorylation abnormally, each molecule Tau protein can contain 5 to 9 phosphate, and lose normal biological function.

This experiment based on optimization and synthesis of tau protein sequences, build the recombinant plasmid and introduced point mutations, induced protein expression in E. coli and optimized the temperature, induction time of expression, used affinity chromatography for purification, to harvest large amounts of purified tau protein, then used them to do vitro functional test.

Key Words：htau；Point mutation；E.coli BL21； protein purification,；Secondary Structure

目录

摘要 I

Abstract II

1 绪论 1

1.1 Tau蛋白 1

1.1.1 Tau蛋白的结构和功能 1

1.1.2 Tau蛋白异常 2

1.1.3 Tau蛋白与阿尔兹海默症 2

1.1.4 Tau蛋白的聚集及其抑制剂 3

1.2 研究的目的,意义和内容 3

2 材料与方法 5

2.1 材料 5

2.2 试剂 5

2.3 仪器 6

2.4 溶液的配置 7

2.5 方法 8

2.5.1 菌种保藏 8

2.5.2 质粒提取 8

2.5.3 氯化钙法制备感受态细胞 9

2.5.4 转化入感受态细胞 9

2.5.5 PCR产物纯化 9

2.5.6 Bradford蛋白质定量实验 10

2.5.7 蛋白纯化 10

3 Tau野生型基因重组表达质粒的构建 11

3.1 设计并构建含tau基因的载体 11

3.2 表达重组体的转化及验证 11

3.3 反向PCR引入点突变，制备突变体菌种 11

3.3.1 引物设计及合成 11

3.3.2 检验引物 11

3.4 反向PCR引入点突变 13

3.5 突变型重组体的转化与筛选 14

3.6 基因测序 15

3.7 小结 16

4 重组蛋白的诱导表达 18

4.1 重组蛋白的诱导表达条件的优化 18

4.1.1 IPTG浓度和诱导表达温度优化 18

4.1.2 总结诱导表达最优条件，表达野生型与突变型Tau蛋白 20

4.2 重组蛋白的纯化 22

4.2.1 Ni-NTA树脂纯化的原理 22

4.2.2 纯化野生型与突变型Tau蛋白 23

4.3 计算纯化产率 24

4.3.1 Bradford蛋白质定量实验 25

4.3.2 计算纯化蛋白的产量 25

4.5 小结 26

5 结论与展望 27

5.1 结论 27

5.2 展望 27

参考文献 28

致谢 29

附录 30

1 绪论

1.1 Tau蛋白

1.1.1 Tau蛋白的结构和功能

Tau蛋白是一种神经微管相关蛋白，能稳定微管并促使微管装配^[1] 。人类tau基因,含有16个内含子和17个外显子，位于17号染色体的长臂上,由于Tau蛋白mRNA剪辑方式不同编码表达6种tau同类物^[2]。从Tau蛋白一级结构来看，其最突出的特点是在tau蛋白的酸性C端含有3～4个含31或32个氨基酸残基的重复区，其主体结构是由Pro－Gly－Gly－Gly的重复序列组成。下图为Tau蛋白在中枢神经系统中诱导产生的维管束结构。由图中可以看出，其C－端区很好的结合在微管的外表面，而这种结合至少有6个二聚体供Tau蛋白分子相互作用，即构成Tau蛋白的微管结合区，促进微管的组装，便可以参与轴突运输。图中游离的是N－末端外伸结构域，它从微管表面外伸出来，与细胞膜和其他细胞骨架成分接触，维持轴突的稳定^[3]。右侧图是由tau蛋白诱导产生的细胞突起内的微管束结构的截面图。tau蛋白在阿尔兹海默症患者的大脑以不溶性纤维存在,Tau蛋白主体的重复区域也可以与双螺旋细丝结合，使其自身不可逆的发生聚合成对螺旋纤维细丝（PHF），形成神经纤维缠结（NFT）并促使神经元发生变性。

图1-1 Tau蛋白诱导产生的维管束结构^[1]