论文总字数：16422字

摘 要

通过磷脂酶D催化生成稀有磷脂化合物磷酯酰丝氨酸是极其有意义和有价值的。这类磷脂化合物可以作为原料提供给化妆品行业、医药制品和饮食行业，所以如何获取大量的磷脂酶D成为大规模工业生产磷脂酰化合物的关键。

本实验首先对磷脂酶D基因进行克隆并导入大肠杆菌进行异源表达生产可以催化卵磷脂与丝氨酸生成磷脂酰丝氨酸的磷脂酶D，然后在两相反应体系中进行反应生产产物，最终对大肠杆菌生产磷脂酶D进行条件优化，使磷脂酶D酶活每毫升发酵液36.8U。阐述主要实验步骤及实验操作，实现链霉菌磷脂酶D基因在大肠杆菌中的高效表达，最终在高效液相色谱蒸发光法检测得到磷脂酰丝氨酸9.22g/L。

本文研究的主要目的是利用磷脂酶D催化卵磷脂与丝氨酸高效生产磷酯酰丝氨酸，提高生产效率，降低生产成本。

关键词：磷脂酶D 异源表达 两相反应 产酶优化

The expression of exogenous phospholipase D gene was constructed in Escherichia coli

Abstract

The phospholipase D catalyzes the production of rare phospholipid phosphatidylserine by phospholipase D is extremely valuable and valuable. This type of phospholipid compound can be used as a raw material for the cosmetics industry, pharmaceutical products and catering industry, so how to obtain large amounts of phospholipase D is the key to large-scale industrial production of phosphatidyl compounds.
In this study, the phospholipase D gene extracted from Streptomyces was PCR and the plasmid pET-22b was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) for heterologous expression to produce phospholipase which catalyzes the production of lecithin and serine phosphatidylserine D, and then in the two-phase reaction system to produce the product, the final production of phospholipase D E. coli conditions to optimize the phospholipase D enzyme activity per milliliter fermentation broth 36.8U. The main experimental steps and experimental operation were carried out to realize the high expression of Streptomyces phospholipase D gene in Escherichia coli. Finally, 9.22 g / L of phosphatidylserine was detected by high performance liquid chromatography (HPLC).
The main purpose of this study is to use phospholipase D to catalyze the efficient production of phosphatidylserine by lecithin and serine, improve production efficiency and reduce production cost.

Key words: Pinocembrin;biological synthesis; Flavonoids; Optimization of enzyme production

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 6

1.1 磷酯酰丝氨酸的价值 6

1.2 磷脂酶D的介绍 6

1.3 生物合成法生产磷脂酶D的研究进展 7

1.3.1 PLD在大肠杆菌中的表达 8

1.3.2 PLD在链霉菌中的表达 8

1.4 本论文的研究目的与内容 9

第二章 实验材料和方法 10

2.1 实验器材 10

2.2 实验试剂 11

2.3 供试菌株及质粒 12

2.4 培养基 12

2.5 大肠杆菌中质粒载体的提取 12

2.6 PCR进行DNA片段扩增 13

2.7 通过酶切连接构建重组表达载体 14

2.8 质粒转化到受体细胞的过程 14

2.9 磷脂酶D在大肠杆菌中的诱导表达 15

2.10 菌体生长测定（以OD₆₀₀表示） 15

2.11 两相体系有机溶剂的选择 15

2.12 两相体系有机溶剂的耐受性 16

2.13 两相体系中pH反应的影响 16

2.14 两相体系中温度pH对酶的影响 16

2.15 两相体系中金属离子对酶活的影响 16

2.16 液相检测方法并分析结果 17

2.17 接种量对产酶的影响 17

2.18 pH对产酶的影响 17

2.19 表面活性剂对产酶的影响 17

2.20 Ca² 对产酶的影响 18

第三章 实验结果和讨论 19

3.1 磷脂酶D基因的验证 19

3.2 菌落PCR验证 19

3.3 两相反应体系优化结果 20

3.3.1 两相反应体系有机溶剂的选择结果 20

3.3.2 两相体系有机溶剂耐受性研究结果 20

3.3.3 两相体系pH对反应影响的研究结果 21

3.3.4 两相体系中温度对酶的影响 22

3.3.5 两相体系中金属离子对酶的影响 23

3.4 产酶优化结果 23

3.4.1 接种量的选择结果 23

3.4.2 pH 及Ca2 浓度对产酶影响 24

3.4.3 表面活性剂的选择结果 25

3.5 液相检测分析结果 26

第四章 结论与展望 27

4.1 结论 27

4.2 展望 27

参考文献 28

致 谢 30

第一章 文献综述

1.1 磷脂酰丝氨酸的价值

磷酯酰丝氨酸（Phosphatidylserine，简称PS），是继“胆碱”和“脑黄金”DNA后新兴的一类健脑类营养素。 专家认为，这类磷脂酰化合物能帮助细胞保持更好的活性，并且能提高大脑中脑细胞传送神经递质的效率，可以激发大脑高效运转，帮助脑细胞读取及存储资料。简单来说，其有以下功能

(1)改善脑能力，集中注意力，提高记忆力

(2)提高学生成绩。

(3)缓解压力，促进疲労回复，平复紧张情绪

(4)帮助修复大脑损伤。

1.2 磷脂酶D的介绍

磷脂酶在细胞内生物稳态和生理调节，以及细胞间信息传递中起重要作用。

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