摘 要

可注射水凝胶已经受到了研究学者们的热切广泛的关注，由于它的可降解性和生物可塑性，已被广泛应用于临床医学、软骨再生和其他组织工程中。

在本实验中，我们将γ型聚谷氨酸（γ-PGA）与甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）反应，从而引入双键，γ-PGA-GMA再与己二酸二酰肼（ADH）反应引入酰肼基。然后，将透明质酸与甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）反应，来引入双键，利用高碘酸钠氧化HA-GMA得到醛基化的HA-GMA。γ-PGA-GMA-ADH的酰肼基与HA-GMA-CHO的醛基通过席夫碱反应进行一次交联，再通过光引发聚合反应进行二次交联。

通过核磁共振谱证明我们成功合成了γ-PGA-GMA-ADH和HA-GMA-CHO。同时，我们也证明了随着水凝胶中固体含量的增加，水凝胶的成胶时间会越来越短，其中5 wt%，7 wt%的水凝胶的成胶时间是在30s左右。由于γ-PGA和HA的高吸水性，它们形成的水凝胶也具有非常好的溶胀性能，水凝胶吸水溶胀后的重量能达到自身的45倍左右。我们还用酶降解实验证明了透明质酸聚谷氨酸二次共价交联水凝胶具有可降解性。

关键词：γ-聚谷氨酸 透明质酸 紫外光辐射 二次交联

Preparation of second covalently cross-linked hydrogel based on hyaluronic acid and polyglutamic acid

Abstract

Injectable hydrogel has attracted the attention of scientists. Due to its degradability and bioplasticity, it has been used in clinical medicine, cartilage regeneration and other tissue engineering.

In this article, we reacted γ-PGA with GMA to introduce double bonds; then γ-PGA-GMA reacted with ADH to introduce the hydrazide group. We reacted HA with GMA to introduce double bonds, we used NaIO₄ to oxidized HA-GMA to achieve aldehydeated HA-GMA.The acyl hydrazide group of γ-PGA-GMA-ADH and the aldehyde group of HA-GMA-CHO were first cross-linked by schiff base reaction, and the second crosslinking is performed by photo-initiated polymerization reaction.

The NMR spectra showed that we successfully synthesized γ-PGA-GMA-ADH and HA-GMA-CHO.At the same time, we also proved that as the solid content in the hydrogel increases, the gelation time of the hydrogel would become shorter, and the gelation time of the 5 wt% , 7 wt% hydrogel is about 30s.Because of the high water absorbency of γ-PGA and HA, the hydrogel formed by them also have very good swelling properties, and the weight of the hydrogel after swelling could reach about 45 times.We have also demonstrated that second covalently cross-linked hydrogel based on hyaluronic acid and polyglutamic acid is degradable by using enzyme degradation test.

Key Words：poly-γ-glutamic acid;hyaluronic acid;ultraviolet radiation;second cro-sslinking.

目录

摘 要............................................................................................................................................. I

ABSTRACT...................................................................................................................................... II

第一章 绪论 1

1.1水凝胶的概述 1

1.2可注射水凝胶 1

1.2.1可注射水凝胶的概述 1

1.2.2可注射水凝胶分类 1

1.2.3可注射水凝胶的制备 2

1.3 γ-聚谷氨酸（γ-PGA） 4

1.4 透明质酸（hyaluronicacid,HA） 4

1.5 甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA) 5

1.6 研究背景及意义 5

1.7实验思路 6

第二章 实验部分 7

2.1实验材料 7

2.2实验方法 8

2.2.1实验前透析袋的准备 8

2.2.2 HA-GMA的制备 8

2.2.3醛基化HA-GMA (HA-GMA-CHO)的制备 8

2.2.4 γ- PGA-GMA的制备 9

2.2.5酰肼化PGA-GMA(PGA-GMA-ADH)的制备 9

2.2.6透明质酸与γ-聚谷氨酸二次共价交联水凝胶的制备 9

第三章 结构表征方法 10

3.1核磁共振谱分析(NMR) 10

3.2成胶时间实验 10

3.3溶胀实验 10

3.4酶降解实验 10

第四章 结果与讨论 11

4.1 γ-PGA-GMA-ADH和HA-GMA-CHO的合成与表征 11

4.1.1γ-PGA-GMA-AD的合成路径 11

4.1.2 HA-GMA-CHO的合成路径 11

4.1.3 γ-PGA组核磁共振谱图 12

4.1.4 HA组核磁共振谱图 13

4.2透明质酸与γ-聚谷氨酸二次共价交联水凝胶的制备与表征 14

4.2.1透明质酸与γ-聚谷氨酸二次共价交联水凝胶成胶时间的测定 15

4.2.2透明质酸与γ-聚谷氨酸二次共价交联水凝胶溶胀性能的测试 16

4.2.3透明质酸与γ-聚谷氨酸二次共价交联水凝胶酶降解测定 17

4.3 结论与展望 18

参考文献 20

致 谢 22

第一章 绪论

1.1水凝胶的概述

水凝胶是一种高分子网络体系，水凝胶的的吸水能力非常的好，它在吸水溶胀的同时又能保持它的形状不会发生形变，所以具有非常好的高保湿效果，由于它的这种性质，水凝胶被应用于多种领域，比如日用品、工业、农业、生物医学等。随着不断地研究发现，水凝胶还具有自我修复和可注射性能，因此水凝胶可以作为未来生物医学应用中的药物和细胞的多种载体应用。

1.2可注射水凝胶

1.2.1可注射水凝胶的概述

在最近这些年，水凝胶凭借它的非常好的保湿的能力、优秀的生物相容性、非常高的水渗透性，与此同时，人们还可以通过人工来合成具有各种各样的性能的水凝胶材料，所以才会广泛应用在生物医学这个领域还有其它一些领域。可注射水凝胶，作为水凝胶的一种，它除了具有具有生物可降解性之外，也有其他不少很好的地方，比如说在人的体内或者体外时，它可以包裹住一些治疗用的药物，或者包裹住一些细胞，并且是有效果的，分布相同的，这种特点就使得它可以应用在微小的创伤手术上；它在一些外力等条件下，可以很容易发生形变而不破裂，这使得在微小的创伤手术上，它可以进入人体体内，输送药物，它还可以使受伤破裂的地方尽快复原，使伤痕痕迹轻微和让伤者减轻疼痛。基于以上这些优点，可注射水凝胶在注射到体内后，会在原位形成类组织构造，会在体内展示出它应该发挥出的作用，这些优点为可注射水凝胶应用在生物医学、药学等方面提供了可能性^[1]。

1.2.2可注射水凝胶分类

按照形成可注射水凝胶的原理，一般可以把可注射水凝胶分成这两大类，就是物理交联以及化学交联水凝胶，在这两大类可注射水凝胶中，通过物理交联的水凝胶被分成了温敏水凝胶以及分子自组装水凝胶等还有其他类型；通过化学交联而成的水凝胶又可以被分为交联剂交联水凝胶、光引发交联水凝胶、辐射交联水凝胶等还有其他类型^[2]。

1.2.3可注射水凝胶的制备

1.化学交联可注射水凝胶: 化学交联可注射水凝胶的分子链和分子链之间会形成一种3D网络结构，而形成这种结构的原因是由于分子链和分子链之间存在着共价键或者离子键，这些化学键通过共价作用或者离子作用交联在了一起。

(1)交联剂交联水凝胶

想要通过交联剂交联来形成水凝胶，首先要做的就是挑选合适的单体，当然还有合适的交联剂，接着用注射的方法使单体以及交联剂进入生物体内，在生物体体温的温度下，在原来的位置发生交联作用从而形成水凝胶。用这种方法来生成水凝胶，很重要的一点就是怎么去挑选符合要求的交联反应和交联剂，在生物体的体内开始交联反应的时候，对反应会出现很严苛的要求，比如：由于生物体的体温几乎一直是维持在一个比较稳定的温度，像人体的体温一般是保持在36℃到37℃之间，那么对于注射进人体的化合物在进行反应时，反应温度自然是不能有太大波动甚至是不能超出这个范围的；单体和溶剂是不能具有毒性的。在进行交联时，水凝胶包裹着的细胞和药物还要能继续维持它们的活性，才能达到一个最终治疗的目的；生物体体内含有大量的水分以及大量的氧气，那么反应自然也是要能够在这个条件下进行的；反应单体进行交联的聚合速率也是有要求的，它必须要符合治疗的要求。基于以上的多重要求，实际上是要同时满足是非常不容易的，所以很难挑选到合适的单体和交联剂，所以这种方法存在一个很大的限制。

(2)辐射交联水凝胶

辐射交联的方式和上面的的交联剂交联的方式比起来存在以下的几个好处：

利用辐射交联而成的水凝胶在形成过程中是不需要加入引发剂的，同时也不需要加入其它可能对生物体存在危害的试剂，自然也就不会用到额外的纯化过程；辐射交联在普通室内温度下就可以进行了，交联密度也能得到比较精确的把握；在一般的条件下，进行辐射交联的同时，还可以同步进行消毒；至于控制产物的产率还有结构等，只要挑选适合的条件就可以了。

(3)光引发聚合水凝胶

光引发聚合水凝胶中需要的主要试剂叫做光引发剂，光引发剂可以吸收光的能量，光引发剂能吸收的光的能量主要是可见光或者紫外光，光引发剂在吸收能量以后，就会产生游离态的自由基等基团，这些自由基会单体产生交联，形成水凝胶。在一定条件下，我们使用光引发剂，比如EDB光引发剂、ITX光引发剂等，再利用可见光或者紫外光的照射，就能使光引发剂吸收能量，从聚合物的分子链上夺取氢从而裂解成活泼的自由基来形成激发态，导致水凝胶的生成。光聚合的好处有很多，比如对温度的要求很低，一般的室内温度或者生理条件就可以；水凝胶从形成到固化的速度很快，在几秒到几分钟之间就可以完成；光引发反应产生的很少的热量，不会伤害到生物体的细胞和组织。

2.物理交联可注射水凝胶

在制备物理交联可注射水凝胶时，是不存在化学反应的。它的交联原理是一种物理反应，分子间存在着很多种类的相互作用力，比如常见的范德华力、疏水作用力等，是分子链和分子链之间正是由于这种相互作用力而产生了交联。

(1)温度敏感型水凝胶

温度敏感型水凝胶也不存在化学反应，它只需要简单的在水里经由一个相转变就可以从溶胶生成水凝胶，当温度敏感型水凝胶进入生物体体内时，会更加的方便，更简单，伤害更轻微。当温度温度敏感型水凝胶作为可注射水凝胶注射入生物体体内时，从体外到体内的一个温度的变化是非常适合的，当体外温度不同于体温时，它是液体体系，当进入人体之后，就会非常快速的生成水凝胶，从而达到治疗的效果。

(2)分子自组装水凝胶

在不一样的条件下，大分子链段自发形成有一定规律顺序的结构，这些结构是微观级大小的，分子链的形态功能很容易受到化学结构组成改变的影响。假如能很好的把握这些微观结构来形成具有高度顺序的结构，就可以模拟出详细的天然分子还有生物体结构体系。

1.3 γ-聚谷氨酸（γ-PGA）

D-谷氨酸以及L-谷氨酸相互作用后，通过共价键结合成一个大分子，同时失去一分子水就形成了 γ-聚谷氨酸(γ-PGA)，γ-聚谷氨酸是很有研究价值的一种生物可降解高分子材料，它有很好的生物相容性，它在生物体体内可以充分发挥功能，一段时间后降解通过新陈代谢就可排出体外。它的结构是直链状的分子链，它优秀的延展性和柔韧性便要归功于它的直线分子；至于它的黏着性、吸水性则是来自于γ-聚谷氨酸中大量的酰胺键和可游离的羧基。

γ-PGA的这些性质使得它在仿生材料的使用上占有一席之地，比如说人造关节软骨^[4]，在一些手术过程当中，特别是当患者伤到骨头的时候，医生就会用到人造关节软骨来治疗患者，因此就会要求制作人造软骨的材料要具备较好的稳定性和生物相容性，此前，就有一种理想的人造软骨材料，是γ-PGA-硫酸软骨素-PCL（聚己内酯）^[3]。

1.4 透明质酸（hyaluronicacid,HA）

透明质酸(hyaluronicacid,HA)，是一种在生物体体内大量存在的线性大分子酸性黏多糖。受外力作用时。抗压强度比较好；在生物体内，与宿主的相容性很好，可以对生物体内组织产生影响和作用；在外力或高温等条件下，发生形变而不产生破裂，可以改变其形状^[5]。

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