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壳聚糖基氧化硅多层膜凝血酶/单宁酸止血敷料的应用

摘要:为了准备一个新的非控制性出血止血敷料，多孔壳聚糖海绵涂有自组装（凝血酶/单宁酸）N薄膜，这是基于氢键作用的凝血酶，在生理pH单宁酸之间根据全血凝血试验，涂层壳聚糖海绵呈明显高凝血由于凝血酶的添加率。另一方面，固定化凝血酶可贮存半衰期延长至室温下66.9天，这比不固定的凝血酶长8.5倍。这是因为固定化效果，不仅多孔结构的壳聚糖海绵，但凝血酶和单宁酸之间的相互作用。此外，单宁酸对壳聚糖具有相似的抗菌作用。因此，它是壳聚糖、凝血酶和单宁酸的优良组合。此外，所有的材料在这项研究已经批准了美国食品和药物管理局（FDA）。因此，基于壳聚糖海绵是一种很有前途的候选人为非控制性出血由于其存储的敷料、生物安全的止血性能和高效。

关键词：壳聚糖；鞣酸；逐层组装；止血敷料。

简介

非控制性出血是导致军事创伤和平民化死亡的主要原因。院前急救，一个理想的止血敷料应稳固、灵活、价格低廉，无不良反应，有效地控制出血。已经开发了一些止血剂，包括纤维蛋白敷料，壳聚糖绷带，沸石粉等。但他们都不能满足所有的要求，虽然他们已经证明在动物和人类研究的功效。例如，沸石粉可能导致严重烧伤。

Chitosan（CS），作为一种天然高分子，已被视为一种止血剂由于其良好的生物相容性的一个理想的候选人，可生物降解的特性和固有的伤口愈合特性。然而，临床上可用的多孔和吸收的壳聚糖海绵表现出有限的疗效，严重出血，如果没有化学修饰或物理共混。将凝血因子加入壳聚糖是提高凝血酶止血效果的一种简便可行的方法，如凝血酶。但是，作为一种高效的外科手术用蛋白止血药，凝血酶应在真空后储存在冷冻环境。

酶固定化技术是一种保护酶性质的广阔前景。壳聚糖海绵作为潜在的固定化载体，可以提高凝血酶的热稳定性。但多孔结构的海绵是能够支持有限的固定效果相比，微球，这是最常见的载体结构。因此，凝血酶仍然需要通过有效的化学或物理边界来固定其他物质。

它已被证实存在氢键相互作用，在生理pH值之间的凝血酶和单宁酸，有丰富的氢键捐赠酚]。逐层（LBL）组件似乎不仅上述问题也是一个很好的解决方案的潜在问题。一方面，凝血酶可以与单宁酸固定的氢键相互作用，这将不会破坏凝血酶活性的二次绑定。另一方面，层层组装可以负荷大和控制量的凝血酶海绵。此外，单宁酸可以提高抗菌和抗氧化活性的海绵。因此，它是壳聚糖、凝血酶和单宁酸的优良组合。此外，所有的材料在这项研究中已通过FDA批准。

因此，该（凝血酶/单宁酸）N薄膜涂布壳聚糖海绵来创建一个存储、生物安全、有效的止血敷料。全血结果凝血支持包覆海绵是一种很有前途的贮藏、生物安全、高效的候选人为非控制性出血敷料。

实验

材料

Chitosan（MV = 5.01times;105）是由青岛海汇生物工程有限公司提供（青岛，中国）与脱乙酰度为90.6%（dono dedit作为礼物赠送）。冻干牛凝血酶粉是从杭康药业有限公司（杭州，中国获得的）。丹宁酸、支链的聚乙烯亚胺（BPEI，Mn = 50100 kDa）和杜氏磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.1 mol／L）是从西格玛奥德里奇获得（St.路易斯，MO）。冻干纤维蛋白原粉（59%蛋白）是由北京jcky化工技术研究所提供（北京，中国）作为一种参考材料。从中国医药集团上海化学试剂公司获得的所有其他材料（上海，中国）除非另有说明。所有其他化学品是市售的分析级试剂。

平板上凝血酶/单宁酸薄膜的制备

为了表征膜的性能，（凝血酶/单宁酸）N膜（N表示的双层数）被组装在硅晶片和镀金的石英晶体。首先，清洗基板

0.01 mol/L PBS（pH 7.4）和干燥氮气，然后浸泡在BPEI溶液（2毫克/毫升，pH值为7.4，在0.01 mol/L PBS）20 min，5 min，用PBS冲洗，。然后，底物浸泡在凝血酶溶液（1毫克/毫升，pH值为7.4，在0.01摩尔/ L的PBS）为15分钟，随后用PBS漂洗5分钟。每次漂洗后，样品由氮气干燥。基板，然后浸泡在单宁酸溶液（2毫克/毫升，pH值为7.4，在0.01摩尔/ L PBS）为15分钟，其次是相同的漂洗和干燥程序。

凝血酶/单宁酸膜厚度的表征

层层组装过程由石英晶体微天平监测（q-sense E4系统，q-sense AB、瑞典）。QCM-D测量频率下降后各交替组装凝血酶和单宁酸。

椭偏仪（M-2000型、伍拉姆、美国）是用来衡量不同的双层数的多层薄膜的厚度。使用连续波长范围从200到1500 nm和入射角为75°进行测量。鲁道夫技术提供的dafibm程序来确定厚度。

壳聚糖海绵/凝血酶/单宁酸膜的制备

首先，以真空冷冻干燥为基质制备多孔壳聚糖海绵。2克的壳聚糖溶解在2%（体积/体积）的水乙酸（60毫升），然后加入2%（体积/体积）NaOH溶液，直到得到均匀的凝胶悬浮液。与中性pH值的脱乙酰壳多糖凝胶得到通过彻底漂洗与三蒸馏。然后用真空冷冻干燥在50C隔夜制成海绵。海绵双层膜（N = 5，10，和15）的过程是类似的平坦基板。

Thrombin固定化壳聚糖海绵的制备

根据上述方法制备了壳聚糖海绵。然后海绵浸泡在凝血酶溶液（1毫克/毫升，pH值为7.4，在0.01 mol/L PBS）15 min，经真空冷冻干燥在50C过夜。

扫描电子显微镜（SEM）观察

通过场发射扫描电子显微镜观察到的形态（海绵铁SEM，fei-sirion）。

涂层海绵凝血酶活性的测定

凝血酶活性，即其从纤维蛋白原形成纤维蛋白的效率，可以通过比较第一纤维蛋白凝块的形成，最终通过凝血酶的初始活性转化为纤维蛋白的时间来确定。首先，一个标准的日志与日志的凝血酶活性凝血时间曲线应通过将已知活性的凝血酶溶液（2毫升）0.2%（W/V）纤维蛋白溶液（1毫升）在37C.然后涂胶海绵凝血酶活性的监测纤维蛋白凝块形成包覆海绵浸泡后的测试（0.02克）在PBS溶液（2毫升）和暴露于相同的纤维蛋白溶液。第一纤维蛋白凝块形成的时间被用来确定凝血酶活性比较标准曲线。通过使用该方法，双层和凝血酶活性的涂层海绵（N = 5，10，和15）之间的关系被证明。

储存稳定性试验

包覆海绵（n = 5）和凝血酶粉存放在室温下（25plusmn;5C）为0、7和31天。通过对凝血酶活性的测定，得到了凝血酶在海绵内和海绵内的贮存稳定性。

全血凝固试验

血液凝固试验是从Shih等。首先，枸橼酸盐抗凝全血（0.2毫升）浸泡后分别在未涂壳聚糖海绵，海绵（n = 5，10，15）和涂层海绵（n = 5，在室温下存放31天）在管。然后，加入20mu;l的0.2 mol/L氯化钙溶液开始混凝。在30转/分钟，分别为0.5分钟，5分钟和15分钟的管动摇。立即，红血细胞（红细胞）没有困在血块冲洗水（25毫升）。紫外线检测器被用来测量所得到的血红蛋白溶液的吸光度在540 nm [ 20 ]。应该指出的是，所有的材料被预热到37°C.

结果与讨论

平面衬底上的薄膜特性

在QCM-D测量如图1所示是凝血酶和单宁酸每个备用组件的频率降低（一）。结果显示形成的凝血酶/单宁酸的多层膜，作为F反映的吸收质量。这表明，在生理pH值是实现层层组装

多层薄膜的厚度（n = 5，10，15）和每双分子层厚度的测定仪，这是显示在图1（b）。结果表明，薄膜的厚度几乎呈线性增加的双层数。这意味着大量的凝血酶可以添加到海绵通过增加双层的数目。每双层膜厚度变化不大，表明薄膜的稳定组装。

海绵的形态

SEM照片的未涂覆的壳聚糖海绵和涂层海绵组（n = 5）如图2所示。通过比较的照片，两个显着的结果，可以得到。一方面，大的存款，观察在高倍率涂布海绵（图2A），而未涂覆海绵（图2B）是一丝不苟。这表明该组件提供显着附加大量凝血酶的海绵。另一方面，多孔结构的涂布海绵（图2C）和未涂覆的海绵（图2D）在低倍率表现出显着的一致性。这意味着层层涂层不会影响海绵的多孔结构，因此涂层海绵还可以促进止血血液中吸收水分和固定化凝血酶的结构。

覆膜海绵的凝血酶活性

通过将已知活性的凝血酶对纤维蛋白原、日志凝血酶活性的标准曲线（LNU）-凝血时间（LNT）如图3所示（一）。图中显示显著的线性相关性LNT和LNU之间的线性相关系数为0.99。用标准曲线方程表示纤维蛋白凝固时间可依次转化为包衣海绵的凝血酶活性：

LnU = 2.6144 11.028times;LNT

其中凝血酶活性及其单位为IU，T为凝血时间，其单位为第二。

通过这种方式，得到的凝血酶活性与不同的双层，如图3所示（b）。与不同的双层膜厚度相比，凝血酶活性揭示了一个相对一致的趋势：活性增强显着的双层增加。它预测的潜力，通过改变双层膜的数量调整涂层海绵的活性。

涂层海绵的贮存稳定性

测定0 d、7 d和31天常温下包裹的海绵和凝血酶粉中凝血酶的活性。凝血酶活性的初始值是指那些被存储为0天，并设置为100%。凝血酶的活性循环比是指凝血酶活性与初始活性的比值。表1显示了不同保温时间的包衣海绵和凝血酶粉中凝血酶的活性回收率。显然，凝血酶在海绵内的贮存稳定性明显优于凝血酶粉。通过公式，存储稳定性可以通过存储半衰期来表示：



在T1 / 2和T的半衰期和存储时间（单位为天）分别为E0和E的初始活性和储存的活性。根据公式，封堵海绵T的半衰期为66.9天，凝血酶半衰期仅为7.9天。说明凝血酶在海绵内的储存半衰期延长了8.5倍，因此在常温下对医用止血剂的包衣海绵相当稳定。

全血凝固结果

血红蛋白溶液在540 nm处的吸光度表示未转化为凝血的红细胞的浓度。因此，吸光度的降低意味着血液凝固的高效率。图4有五个重要结论。首先，与空白相比，壳聚糖海绵止血效果有限。由于加入凝血酶，涂层海绵造成显着较高的血液凝固率比未涂覆海绵在同一时间内。壳聚糖海绵固定化凝血酶比LBL涂层海绵止血有效率低，说明LBL组装

大剂量凝血酶浸泡法的优势。此外，涂布海绵的血液凝固率增加双层增加。的趋势是一致的凝血酶活性和双层之间的关系。LBL 5-1 5-2显示相比，LBL凝血率小的差距即使有31天在室温下储存。为了证实这些结论直观，图5与血液凝固和未凝固的血红蛋白溶液显示这些敷料。浅色的血红蛋白溶液和敷料重颜色意味着更高的效率，血液凝固

结论

为了准备一个新的非控制性出血止血敷料，多孔壳聚糖海绵涂有自组装（凝血酶/单宁酸）N薄膜，这是基于氢键作用的凝血酶和在生理pH值实验结果表明新型敷料的优点三单宁酸之间。首先，涂层海绵表现出显着高的血液凝固率，由于加入凝血酶。其次，止血活性增强的双层的增加，这预测的潜力，以调节止血效率的涂层海绵的双层数。第三，涂层海绵的半衰期（n = 5）为66.9天，约为未定影凝血酶的8.5倍。这意味着海绵作为急救止血剂是相当稳定的。此外，本研究中的所有材料已被FDA批准。因此，壳聚糖基海绵是一种很有前途的候选人为非控制性出血由于其存储的敷料、生物安全的止血性能和高效。

参考文献

[1]Sauaia, A., Moore, F.A., Moore, E.E., Moser, K.S., Brennan, R., Read, R.A. and Pons, P.T., J. Trauma, 1995, 38: 185

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