摘 要

活性污泥在城市污水处理中起着至关重要的作用，研究活性污泥中的菌群结构及功能，提高活性污泥系统中微生物群落的种类与多样性，能够有效提高污水处理效率。此外，活性污泥中菌群结构的相关研究，可以为污水厂的调控提供理论依据。本研究对武汉市某污水处理厂好氧区取得的活性污泥，进行高通量测序，获得污泥样品中所有微生物的16S rDNA序列，并鉴定出微生物的种类。根据测序结果，得到污水处理厂污泥中的优势菌，并分析其菌群结构以及功能菌在污水处理过程中所起的作用。结果表明：变形菌门 ( Proteobacteria)与拟杆菌门( Bacteroidetes)相对丰度分别为61.1%和19.3%，占该活性污泥中微生物的绝大多数。在属水平上，Dokdonella相对丰度最高，为4.76%，其次为Azonexus，Dechloromonas等。活性污泥中某些优势菌属在污水处理过程中发挥着特定的功能，如Azoarcus具有固氮和反硝化作用、Rhodocyclus具有聚磷作用、Nitrospira具有硝化作用等，但仍有部分细菌未能确定其功能。

关键词：活性污泥；菌群结构；高通量测序；功能菌

Abstract

Activated sludge plays an important role in the treatment of municipal sewage. It is necessary to study the structure and function of bacteria in activated sludge, improve the species and diversity of microbial communities in activated sludge system, and improve the efficiency of sewage treatment. In addition, the relevant research on the microbial structure of activated sludge can provide a theoretical basis for the regulation of sewage plant. In this study, 16S rDNA sequences of all microorganisms in sludge samples were obtained by high-throughput sequencing of activated sludge obtained from aerobic zone of a sewage treatment plant in Wuhan, and the types of microbes were identified. According to the sequencing results, the dominant bacteria in the sludge of the sewage treatment plant were obtained, and the structure of the flora and the function of the functional bacteria in the sewage treatment were analyzed. The results showed that the relative abundance of Proteobacteria and Bacteroidetes were 61.1% and 19.3%, respectively, which accounted for the vast majority of microorganisms in the activated sludge. At the level, Dokdonella had the highest abundance of 4.76%, followed by Azonexus, Dechloromonas and so on. Some dominant bacteria in the activated sludge play a specific role in the sewage treatment process, such as Azoarcus with nitrogen and denitrification, Rhodocyclus with polyphosphate, Nitrospira with nitrification, etc,but still some bacteria failed to determine its features.

Key Words：Activated sludge; flora structure; high-throughput sequencing; functional bacteria

目 录

第1章 绪论 1

1.1活性污泥菌群结构研究方法 1

1.1.1 培养基选择分离 1

1.1.2 变性/温度梯度凝胶电泳 1

1.1.3 16S rRNA—PCR技术 2

1.1.4 荧光原位杂交技术及其相关技术 2

1.1.5 现代培养技术 3

1.2 活性污泥菌群结构研究进展 3

1.3课题背景、目的及意义 4

1.3.1课题背景 4

1.3.2目的及意义 4

第2章实验内容 5

2.1材料和设备 5

实验设备 5

2.2实验方法 5

2.2.1污泥样品的采集及预处理 5

2.2.2高通量测序 5

2.4 测序数据分析 10

2.4.1数据预处理 10

2.4.2 操作分类单元 (OTU) 分类 10

2.4.3 样品丰富度和多样性分析 11

2.4.4 物种分类 11

3.结果与讨论 12

3.1高通量测序的统计学分析 12

3.2菌群结构 12

3.3 污泥中主要菌属的功能 14

4.结论与展望 17

参考文献 18

致 谢 22

第1章 绪论

1.1活性污泥菌群结构研究方法

在污水处理厂，活性污泥是将污染物转化的主要部分，污水处理厂处理污水的能力取决于它的生物活性，而微生物菌群的结构和功能又决定了活性污泥的生物活性^[1]。微生物在活性污泥中的种类非常丰富，细菌是其中最主要的成分。随着理论知识和分子生物技术的进步，对微生物群落结构的研究方法也在不断改进。目前，常用的微生物菌群结构的研究方法有培养基选择分离、变性/温度梯度凝胶电泳、16S rRNA序列比较、荧光原位杂交技术及其相关技术、现代培养技术等。

1.1.1 培养基选择分离

在含有高浓度营养物的选择性培养基中接种一定量样品，然后统计其生长的菌落，观察各种微生物群落的生化特性与形态结构，在种属上进行分类鉴定。此方法是微生物研究的重要手段之一，该方法在研究活性污泥菌群中占据着重要的地位。

在研究微生物结构及功能上，传统的纯培养技术会受到很大的限制，这种检测出的细菌只是很小一部分（占细菌总数的0.1%～1%），并且培养分离过程的时间久，操作量很大，这导致如今微生物在污水处理过程发挥的作用仍在初步的研究阶段^[2]。

这种方法的要求比较低，在分离一些具有特定功能的微生物时十分适用，且一部分科研工作者在研究时也常用到此方法。但它的局限性在于：培养基对特定菌群具有选择性；有些细菌和其它细菌之间存在着共生现象，无法独自生长（这类细菌仍占无法培养微生物的大部分）；许多细菌的形态相似且生理生化特性难以辨识^[1]。因此，这种方法在研究活性污泥的菌群结构时，并不全面，特别是在研究某些具有重要的功能但无法培养的菌群。

1.1.2 变性/温度梯度凝胶电泳

由于分子生物学的发展和聚合酶链式反应技术的逐渐成熟，有的基于PCR技术的分子指纹技术，例如：变性梯度凝胶电泳、末端限制性片段多态性与长度多态片段PCR等，已经开始应用到环境微生物种群结构的分析。这些方法的优点是不会受到微生物实验室培养的限制，因而可以获取相对更加全面的种群信息。

变性/温度梯度凝胶电泳（DGGE/TGGE）通过比较双链DNA片断熔解时的不同行为，进而对PCR产物中长度一样、但是序列不同有差异的DNA标记片断（rRNA或rDNA）进行分离。根据鉴定结果可知，一个微生物类群由DGGE/TGGE指纹图上的一条带表示。因此，指纹图谱不仅可以直接得到微生物群落的结构与种类的数量，还便于得到出功能菌或优势菌。这种方法在活性污泥菌群的研究中普遍应用^[3]。

变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Elec-trophoresis, DGGE）和温度梯度凝胶电泳（Temperature Gradient Gel Eleectrophoresis TGGE）都属于DNA指纹图谱技术。有研究显示，对于有多个不同碱基序列差异的DNA片段分离时，DGGE存在一定的局限性，Sekiguchi等指出，DGGE方法对环境微生物种群的多样性研究不够全面^[2]。因此，为了对活性污泥样品中的微生物种群多样性作出更详细的研究，就要结合DGGE/TGGE与其它的分子生物学方法相结合。

1993年Muyzer等第一次在微生物研究上采用DGGE，对分子大小一样、但序列有差异的16sr DNA片段进行分析，基于不同细菌中其核糖体小亚基基因可变区碱基序列存在差异，具体研究出其种群的微生物的多样性及数量上的差异^[2]。在微生物分子生态学上，采用DGGE和TGGE技术，可能对复杂的微生物种群的研究更为容易，同时可能使微生物种群变化的研究更为深入。一般情况下，根据指纹图谱中条带的多少，表示微生物种类的数目；根据条带的染色程度，表示菌种的丰富度差异。高平平等采用16sr DNA—PCR／TGGE指纹图谱技术，选取某个焦化工业污水处理厂两个功能不一样的好氧池中活性污泥的菌群结构，研究一段时间内的菌群变化，其结果表明，在这两个好氧池中，主要的降解菌群存在差异^[3]。

1.1.3 16S rRNA—PCR技术

PCR产物经过DGGE等电泳技术后，对凝胶条带回收测序，把菌群分类并初步分析，但是经过建立细菌16S rRNA文库，能够更深入地研究。rRNA序列比较的方法是经过研究缓慢进化的rRNA分子成分，然后在微生物整体上分类。该技术的主要步骤为:（1）提取样品中的总DNA；（2）在λ噬菌体的基础上构造DNA克隆文库；（3）根据种类特异性的16S rRNA探针筛选文库；（4）测序；（5）序列的比较分析^[1]。

在含酚污水处理的研究中，高平平等针对4种种类不同的降酚菌研究出专一性的引物和探针，经过PCR扩增后进行检测这些菌群在污水处理过程中的结构与功能，而且在降酚菌的分类时准确到属^[3]。近几年，为研究活性污泥中主要的功能菌和菌群的多样性，也有人使用16sr RNA—LPM技术。这种技术是使用了基于长度多态性（Length Polymorphism）和GC含量的二维16sr DNA相结合的技术，能够准确分析出活性污泥中的菌群种类，该方法在使用16sr DNA中变异区域I时，有更明显的效果。谢冰等是使用16sr RNA—LPM的技术，研究处理受重金属污染的环境中细菌的菌群结构。

1.1.4 荧光原位杂交技术及其相关技术

近年来，对于传统的微生物分析方法出现了一些问题，在污水处理领域的一部分研究者开始尝试把荧光原位杂交技术（Fluorescent In Situ Hybridazation，FISH）应用到导致污泥膨胀的脱氮细菌菌群、丝状菌菌群、产甲烷菌菌群、除磷菌菌群等的分析中，并有了初步的成效。谢冰等使用FISH方法检测了活性污泥中的硝化细菌，其检测结果显示，它该方法在对活性污泥中的无法培养的微生物检测效果也很好^[2]。

FISH作为一种微生物数量和特性的研究手段，有着种属的特异性，指只和目标细菌的16Sr RNA或23S rRNA结合，根据与之结合的探针而鉴定出微生物的种类。和其他可以能够使微生物量化的方法（如PCR）相比，FISH技术还可以得到微生物种群的结构与数量信息。研究显示，该技术对特定的微生物种群定性和定量检测时，得到结果快，能自动读取存储和回顾载物片信息，选择性好，灵敏度高，取样容易少量，并且能提供更多的物理参数。

FISH技术的优势是能够得到微生物在污泥中的数量、形态及分布状态等，但是，在应用的过程中，存在检测的假阳性和假阴性问题，比如：探针缺乏特异性、微生物自身荧光的影响、低r RNA、穿透率不足含量和荧光褪色等。

1.1.5 现代培养技术

尽管免培养分子生物学技术在活性污泥中检测到有很多具有生物活性却无法培养(Viable butnonculturable，VBNC)菌群,同时也能研究活性污泥中的菌群的结构与功能，但是对其菌群的生理生化特性及功能特性进一步研究时，纯培养物是必不可少的。可由于传统的培养方法的对一些菌群发育有一定的限制，这使得纯培养物难以获得。因而，为了得到VBNC菌群的纯培养物，就必须找到适合培养该菌群的方法。

经过多年的研究，很多研究人员在新的微生物培养技术研究中发现，当菌群的生长环境与与活性污泥处理过程中的环境差别很小时，可能会出现一些VBNC菌群的纯培养物。目前，现代培养技术的方法有：①单细胞操作技术(例如：激光显微解剖法及光镊技术)；②模拟自然环境(例如：延长培养的时间；降低营养物质浓度；加入非传统营养物、抑制因子或信号分子；直接在自然环境接种)；③微胶囊裹细胞法^[5]。2002年Zengler等研究出一种微胶囊裹细胞法，在营养物含量较低的情况下，同时培养大量包裹的细胞，再使用流式细胞仪(FCM)检测出含有微克隆的微滴，这种方法在海水和土壤等环境样品中VBNC微生物的研究中得到验证^[6]，并且，在2005年他们在营养物浓度较高的条件下，对FCM分选到的目的微滴进行接种并大量培养，通过此方法可以获得很多在活性污泥中含量较少菌群^[7]。

现代培养技术主要应用在新发现的菌群结构和功能研究中，人们已培养出许多传统的培养方法无法培养的培养物，例如Maszenan等人分离培养出了属于α-变形杆菌的Defluvicoccus vanus gen. nov.,sp. nov.^[8]以及Soddell等人分离培养的属于放线菌的Millisia brevis gen. nov., sp. nov.^[9]。Heylen等采用优化后的培养基培养出活性污泥中99个反硝化细菌,多数属于β-变形杆菌(50. 4%)与α-变形杆菌(36. 8%),其次有γ-变形杆菌(5. 6%)、厚壁菌门(Firmicutes)(4%)、δ-变形杆菌(2%)与一个拟杆菌门菌株。结果表明，采用现代培养技术得到的反硝化菌群种类更加丰富^[10]。

1.2 活性污泥菌群结构研究进展

活性污泥在污水处理厂中处理污水系统发挥着主要功能。在20世纪80年代之前，在活性污泥微生物结构研究中，传统的分离培养法是主要的研究方法，但是培养的细菌数量只在活性污泥微生物总数的占到1%～15%。到了20世纪80年代后期，由于16S rRNA的出现，许多以此为基础的免培养分子生物技术迅速发展起来，如克隆文库技术、电泳技术、PCR技术、流式细胞术（FCM）与荧光原位杂交（FISH）等，这些技术逐渐成为研究活性污泥中菌群结构与功能的主要方法，菌群结构的复杂性与菌群种类的多样性逐渐为人们所认识，很多传统检测方法无法发现但在活性污泥中起着关键作用的微生物逐渐被人们发现。为了深入研究免培养法发现的很多新菌群的生理特性和功能，在20世纪90年代后期，很多模拟活性污泥菌群生存环境的现代培养技术发展起来，并且已经成功地培养出一些传统分离培养技术无法培养的新培养物，这促使人们深入研究活性污泥的菌群结构与功能^[2]。

活性污泥法在污水处理研究中占据着重要地位，这种方法对于人们研究微生物的种群有着重要意义。虽然如今的相关技术在不断发展，活性污泥中的微生物种类和功能也逐渐被了解，但是仍然有部分菌群有待人们去研究。由于在微生物领域的技术发展，在活性污泥菌群研究过程中，仍会有新的研究技术出现，比如说，在国外的免疫培养技术与现代培养技术已得到应用并取得了一定成果，但是，在国内，活性污泥菌群研究中，这些最新的技术未得到广泛应用。不过，关于活性污泥的研究方法在不断更新，人们也会深入了解活性污泥的菌群结构与功能。这对今后更好地利用活性污泥，探索污水处理系统中生物和环境之间的生态学联系，并使污水处理的体制更加完善有着深刻的理论研究意义和实际应用价值。

1.3课题背景、目的及意义

1.3.1课题背景

随着工业的发展和人民生活水平的提高，城市污水产生量在不断增大，为处理生活污水和工业废水，污水处理厂在现代生活中扮演这不可或缺的角色。提高污水厂的处理效率，对环境保护有着重大意义。活性污泥中的菌群在污水处理过程中发挥着重要作用，本文通过活性污泥中的菌群结构和功能的研究，可以从微观上分析污水处理厂的运行机理，同时对无数及处理过程中出现的一些问题作出解释，为污水处理厂的运行及调控提供理论指导。

1.3.2目的及意义

在污水处理中，活性污泥法是处理城市污水的主要方法，生化处理是其过程中的重要环节。活性污泥法是通过不断向废水中通入空气，利用活性污泥中的微生物摄取污水中的有机物，进行新陈代谢，从而除去有机物，净化污水。活性污泥是处理污水的核心，主要包括各种微生物，如原生动物、真菌、后生动物、细菌、藻类和病毒等 ，其中细菌约占总微生物种群的95％，并在废水处理中起着关键作用^[11]。因此，分析污泥中的菌落结构，得到活性污泥中优势菌，以及优势菌在污水处理过程中的功能，对污水处理的优化有着重要作用。目前，人们对污泥菌落功能还没有系统的研究。

第2章实验内容

2.1材料和设备

实验设备

本次实验用到的设备详见表2-1。

表2-1 实验设备

2.2实验方法

2.2.1污泥样品的采集及预处理

取适量接种污泥，以2000 rpm离心10 min除去大部分水分，经-20°C冰箱中预冷冻后，于冷冻干燥机中真空冷冻干燥，最后保存在-70°C冰箱中。

2.2.2高通量测序

高通量测序原理

（1）首先把PRC扩增的单链DNA和引物杂交，并与ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、荧光素霉、5’-磷酸硫酸腺苷和底物荧光素酶共同孵育。

（2）在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶及将其加入引物链中，并释放等摩尔数的焦磷酸。