摘 要

最早诞生于光化学领域的瞬态吸收是一种时间分辨的光谱技术，它利用一束精确控制的调制脉冲泵浦激光去激发样品，同时采用另一束具有一定时延的、未经调制的探测激光去照射样品，根据调制信号的转移来获取探测样品被脉冲光激发和弛豫过程中光吸收发生的变化。

本文则是基于瞬态吸收显微成像技术具有的无标记、对比度及分辨率高等优势，对不同含氧量血细胞的特征展开了研究。所作的工作有：首先，基于大量的文献调研，学习了各种瞬态吸收成像方式的基本原理，了解了血细胞的含氧浓度与肿瘤生长的关系；其次，搭建并优化了瞬态吸收显微成像光路；最后，开展了四次关键性实验，测试了多组样本的超快动力学曲线，即Time-Delay曲线。

研究结果表明：血液在受泵浦光激发后产生的瞬态吸收曲线与探测光波长存在明显依赖关系，即随着波长的增大其负值信号越强；并且在测试波长下，高含氧量血液的负值信号都要比低含氧量血液强，能够实现二者的区分，为今后实现单细胞的血氧浓度成像提供基础。

关键词： 瞬态吸收；泵浦探测；血氧浓度；时间分辨

Abstract

Transient absorption, first born in photochemistry, is a time-resolved spectrum technology, which uses a beam of precise control of modulation pulse laser to inspire samples, while using an unmodulated beam with a certain delay irradiation samples. According to the transfer of modulation signal, we can obtain the change of light absorption occurring in this process of the excitation and relaxation.

In this paper, the characteristics of blood cells with different oxygenation were studied, based on the advantages of transient absorption, which are unmarked, high contrast and high resolution and so on. First of all, based on a large number of literature research, the basic principles of various transient absorption imaging methods were studied, and the relationship between oxygen concentration and tumor growth in blood cells was understood. Secondly, the light path of transient absorption microscopic imaging is constructed and optimized. Finally, with multiple samples, four key experiments were carried out and the hyperkinetic curves which also named as Time-Delay curves were tested.

The results show that the time-delay curve generated by the pump is dependent on the detection light wavelength, i.e., the negative signal becomes stronger as the wavelength of probing beam increases. And under the test wavelengths, the negative signal of blood with high oxygenation is greater than that with low oxygenation, which is the distinction between them. These works will make it happen of the realization of single-cell blood oxygenation imaging.

Keywords: Transient absorption; pump-probe; blood oxygenation; time-resolved

目 录

第1章 绪论 1

1.1 生物医学显微成像技术概述 1

1.1.1 电子计算机断层扫描显微成像（CT） 1

1.1.2 超声波显微成像（US） 1

1.1.3 光声显微成像（PA） 1

1.1.4 红外光谱显微成像（IRS） 2

1.1.5 瞬态吸收显微成像（TA） 2

1.2 瞬态吸收显微成像的优势 2

1.3 本文的工作 5

第2章 瞬态吸收显微成像原理 7

2.1 非线性显微成像的基本原理 7

2.1.1 谐波产生 7

2.1.2 振动波谱 8

2.2 瞬态吸收显微成像的调制过程 12

第3章 实验系统的搭建 14

3.1 基于调制-解调的关键技术 14

3.1.1 高频调制 14

3.1.2 调制转移 16

3.1.3 信号解调 16

3.2 实验光路的搭建与优化 19

3.2.1 光路的初步搭建 19

3.2.2 光路的优化调试 22

3.3 样本的获取 26

第4章 实验结果及分析 29

4.1 医院血样的测试结果 29

4.2 人指尖血的测试结果 30

4.3 现场鼠血的测试结果 36

4.4 血红蛋白的测试结果 38

第5章 总结与展望 41

5.1 工作总结 41

5.2 未来展望 41

参考文献 47

附录A 50

附录B 51

致谢 53

第1章 绪论

对血管结构及血液动力学的微观层面的研究，可以提供生物医学应用上的众多信息。例如，相较于健康组织，肿瘤中生长的血管具有：形态不规则、血氧浓度低等与众不同的特点^[2,3]。这些特征为肿瘤的预诊断提供了必要的参量，使得我们可以在早期阶段就发现肿瘤的存在，并通过治疗及时的将癌细胞扼杀，减小肿瘤恶化给患者带来的痛苦。而显微成像技术可以对血管形态学进行直观可视化，此外，在成像数据的分析中，还可能获取其病理性信息；因此，本课题的研究在生物医学上具有重要意义。

在本章篇幅中，首先基于所调研的文献，概述在生物医学上所采用的部分显微成像技术；其次，分析瞬态吸收在本课题研究中具有的显著优势；最后，明确本课题需要完成的工作。

1.1 生物医学显微成像技术概述

1.1.1 电子计算机断层扫描显微成像（CT）

电子计算机断层扫描成像基于人体的不同组织对X射线的吸收和透过率的不同，采用高灵敏度仪器对人体进行扫描，然后将测量所获取的数据传输至电子计算机中，再经由计算机的处理，最终就可以拍摄到人体组织的截面或三维图像，进而发现其细小病变^[4,5]。在生物医学上，CT对颅内肿瘤、大肠肿瘤、腹盆腔神经肿瘤和脊椎肿瘤等众多病变都具有较大的诊断价值。

1.1.2 超声波显微成像（US）

在超声波的研究中，一种传感器（也称为探针）用于发送和接收声波。简单地说，传感器先将电信号转换为超声波，当超声波进入人体后，有部分反射回传感器的声波被探测到并重新转换为电信号。这些信号被计算机处理，然后显示为图像。临床诊断超声波扫描仪一般在1到20兆赫之间选取频率^[4,6]，目前普遍应用于心血管系统、消化系统及泌尿系统的诊断。

1.1.3 光声显微成像（PA）

光声成像是通过激光脉冲持续几纳秒照射在感兴趣的组织上来实现的。这些红外线脉冲会使得组织局部加热，导致热弹性膨胀并随后产生超声波。该声波可以在皮肤表面检测到；因此，通过测量声波的振幅和到达时间，就可以确定生物组织的结构。目前在血管形态成像上已有明确应用^[4,7]。但需要注意的是，输入源不需要是红外光，也可以是其他形式的能量，包括辐射，它与下面即将提到的红外光谱成像有明显差异。

1.1.4 红外光谱显微成像（IRS）

当一束具有宽谱或窄谱可调的红外光通过物质时，物质分子对红外光产生吸收作用。而组成分子的各个基团都具有各自特定的红外吸收特征峰，即使基团所处的环境会对吸收峰位置造成偏移，但只要仍在容许范围条件内（通常生物组织都满足），同一种官能团的吸收振动总是出现在一个较窄的波数范围内，所以仍具有较高的特异性。对样本红外光谱分析，可以得出物质主要成分的构成，从而完成物质对比成像。由于红细胞中的血红蛋白对其具有良好的选择吸收能力，因此，该方法在对血液含氧量的分析上得到一定的应用^[4,8]。

1.1.5 瞬态吸收显微成像（TA）

利用一束精确控制的调制脉冲激光去激发样品，同时以一束具有一定时延的、未经调制的激光照射样品，根据调制信号的转移来获取探测样品被脉冲光激发过程中光吸收发生的变化，再由锁相放大器解调出变化强度，作为每个像素的灰度值。这种基于非线性光学过程的成像方式，由于其非线性条件而具有本征三维层析能力，并且由于成像对比度来源于样本自身的原子能级跃迁，所以不需要外来标记物（Label-free），在生物活体成像上具有显著优势^[9]。

1.2 瞬态吸收显微成像的优势

在1.1节中提及的各种显微成像方法中，电子计算机断层扫描、超声波成像都具备测量很多重要参数的能力，如血液流动速率、血管直径以及血管密度等，在癌症治疗中，对血管生成抑制剂的评估有着潜在的应用价值。但是，这些方法大多需要标记物，不具备分辨个别毛细血管的能力 ，也很难测出血红蛋白的含氧浓度。此外，光声成像存在透射深度低的缺点，难以获取全面的信息；而红外光谱虽然能够对红细胞中的血红蛋白进行成像分析，但人体组织对红外光的散射系数较高，使得其成像分辨率限制在mm量级。其它的一些显微技术，如共聚焦显微镜和双光子荧光显微镜，它们固有的三维分割能力可以阻止部分的散射，但可惜的是，血红蛋白是一种非荧光标记分子，不能被直接成像^[12,19]。

由于在皮秒或飞秒时间尺度下，泵浦光激发的分子动力学弛豫现象存在更为复杂及多样的过程^[9]；因此，通过超短脉冲调制转移的瞬态吸收（Transient absorption）成像方式是一种免标记、能够产生很强对比度并且具有本征三维层析能力的技术，可以对生物和医学组织提供高特异性的图像。由调研的文献来看，最早的飞秒瞬态吸收成像实验使用了摄影感光片技术，在100 fs至600 fs时间尺度上记录了光诱导产生的硅材料融化与蒸发过程^[10]。而经由这些年不断的发展，现如今，瞬态吸收技术可以基于受激拉曼散射、双光子吸收、激发态吸收、受激辐射或者基态损失等非线性光学过程，通过对传输光或散射光的简单探测，从而获得高质量的成像图片；并且，因为是在很短的时间内就获得了足够的灵敏度，完成了对特异性组织的成像，所以信噪比也有一定程度的提高^[11]。图1.1所示即为一台瞬态吸收成像系统的仪器。

1. 瞬态吸收成像仪器

据报道，国外研究小组至今已分别在细胞和活体动物层面，对脂质、蛋白质、葡萄糖和一些其它的生物分子的代谢过程进行了研究，且都取得了良好进展。例如，基于双光子吸收和激发态吸收技术， Dan Fu课题组于2007年，通过交换泵浦光和探测光的光波长完成了对红细胞中的氧合/脱氧血红蛋白的区分，并三维重构了红细胞的立体图像^[12]；2009年，谢晓亮（X.Sunney Xie）等人基于受激辐射技术，在光动力疗法中对鼠耳皮下不同深度的甲苯胺蓝（toluidine blue O）输送，以及大肠杆菌中两种编码的非荧光色素蛋白（gtCP and cjBlue）进行了成像^[13]；2010年，基于受激拉曼散射技术，他们完成了脂肪调控机制的基因组筛选，找到了8个新的调控基因^[14]；不久，在2014年于《Nature Chemistry》杂志上报道了对酪氨酸激酶抑制剂在细胞中的分布的定量成像^[15]；一年后，又在活体哺乳动物中观察到了皮肤细胞的有丝分裂过程^[16]。它们分别如图1.2-1.6所示。此外，复旦大学的季敏标教授课题组前不久于《Nano Letters》发表文章，利用光漂白和红移光诱导吸收的方法，观测了黑磷在层数依赖上的共振瞬态吸收波谱，从而揭示了黑磷在光激发下产生的强库伦相互作用和电子-光子耦合效应^[17]。

1. 红细胞的三维构型图；标尺：25 μm

1. 甲苯胺蓝在鼠耳皮下的输送：

（a）深度3 μm，（b）深度25 μm；标尺：15 μm

1. 大肠杆菌中两种编码的非荧光色素蛋白：

（a）gtCP，（b）cjBlue；标尺：2 μm

1. 酪氨酸激酶抑制剂（黄色实线包围）在细胞中的分布图像：

（a）抑制剂为伊马替尼，（b）抑制剂为尼罗替尼；标尺：5 μm

1. 哺乳动物皮肤细胞的有丝分裂过程图像：

（a）~（f）依次为间期、前期、前中期、中期、后期和末期；标尺：10 μm

1.3 本文的工作

本文的工作集中在，介绍瞬态吸收成像的基本原理和方法，完成实验光路的搭建，以及基于平台和控制程序对血红蛋白样本进行瞬态吸收显微成像，并根据绘制的时间延迟曲线完成不同含氧浓度红细胞的区分，进而得出一系列的分析结果。其中，章节安排如下：

第一章基于所调研的文献，概述在生物医学上所采用的部分显微成像技术，进而分析瞬态吸收在本课题研究中具有的显著优势。

第二章基于非线性显微成像的概念，聚焦瞬态吸收的调制技术，对几种现已建立起来的瞬态吸收方法展开讨论。

第三章基于调制-解调的几个关键技术，详细说明实验光路的搭建与优化调试过程中遇到的问题及解决方法，为后续成像实验做好准备。

第四章基于之前搭建的实验光路，以时间节点为主线，详细说明我们使用动静脉血以及脱氧、氧合血红蛋白等样本进行的一系列实验结果与分析过程。

第五章则基于对本文工作的总结，认真分析本次毕业设计取得的成果以及存在的改进之处，并对展望的可行性做出了实质性先驱验证，为研究生期间的工作奠定基础。

第2章 瞬态吸收显微成像原理

瞬态吸收是一种时间分辨技术，最早诞生于光化学领域。它利用一束精确控制的调制脉冲激光去激发样品，同时采用一束具有一定时延的、未经调制的激光照射样品，根据调制信号的转移来获取探测样品被脉冲光激发过程中光吸收发生的变化。因此，瞬态吸收也被形象地称为“泵浦-探测”技术。同时，由于瞬态吸收概念的宽泛性和笼统性，使其可以适用于各种各样的非线性作用^[9]。

本章将首先回顾非线性显微成像的基本概念；然后聚焦于瞬态吸收的特点，即调制技术，对几种现已建立起来的瞬态吸收方法展开讨论。

2.1 非线性显微成像的基本原理

通常地，显微成像的对比度来自于样本和周围介质结构不同而导致的光学参数不同。在亮场透射显微成像中，入射光被半透明生物样本所散射和吸收，从而导致传输光强度变化。总体而言，光与物质相互作用是由物质的电极化率决定的。在常见照明强度下，如卤素灯和大多数连续激光，电磁响应与入射光强度的幅值成线性关系；然而，在高入射强度时，光与物质的相互作用还受到电极化率的高阶项影响，以致于与入射场成明显的非线性。由非线性光学基础概念可知，极化强度可以写成：

（2.1）

式中，是真空介电常数，是i阶电极化率，是入射光波电场强度。

事实上，正是由于激光的发明才使得非线性光学现象得以实际观测和应用。许多非线性光学过程最初被用于拓展激光光源的波长范围和测量电极化率的高分辨率光谱，之后，经过一定的发展后，这些技术才逐渐在显微成像中得以应用。

在非线性光学显微成像中，电极化率的高阶项是样本化学键和结构的特征，被用于产生高强度激光照射下的成像信号^[18,34]。下面将简要讨论这些非线性光与物质相互作用是如何移植到生物成像应用上的，该部分包括电磁辐射的谐波产生和化学键共振振动的激发辐射两类典型波长转换非线性过程。

2.1.1 谐波产生

当电磁波与一个非线性介质相互作用时，电磁波可以彼此混合并在最初频率之和或之差的频率上产生一个新的分量。如果入射光的频率恰好相等，那么产生的分量就称为该频率的谐波。如图2.1所示的二次谐波（SHG）过程，两个频率为ω的光子与介质作用，产生了一个频率为2ω的光子^[20]。图中，实横线表示实能级，虚横线表示虚能级；实箭头表示入射光子，虚箭头表示探测光子（图2.2-2.4类似，以下不再赘述）。该过程由虚能态的跃迁所调控。其中，需要注意的是，虚能态是一种在物理上不存在的中间量子态，但它却使许多光学过程成为可能，之后对受激拉曼散射等的分析会再次提及。

1. 二次谐波的能级图

由于二次谐波是二阶非线性过程，所以它在中心反演对称结构的物质中是不存在的。然而，在非中心对称物质，或在两个中心对称介质的交界面，对称性被打破，二次谐波可以产生。许多生物结构都有这样的分子排布，如胶原、肌丝、生物膜和纺锤体，因此在合适的入射场下可以出现二次谐波^[21-23]。

以上是毕业论文大纲或资料介绍，该课题完整毕业论文、开题报告、任务书、程序设计、图纸设计等资料请添加微信获取，微信号：bysjorg。

相关图片展示：