摘 要

本文主要研究的是两亲性树状多肽的合成以及其载药性能的研究。详细介绍总结了树状多肽的定义和分类，树状多肽的合成方法，介绍了树状多肽在在携载抗肿瘤方面的生物医学应用。本文的实验的主要内容为合成扇形树状多肽，由于氨基极易吸水，需要将合成的树状多肽的尾部接上疏水尾巴，利于水分排出，增强结构稳定性。然后将合成的材料做成胶束进行载药。树状多肽合成以后将其进行表征，比较分析载药前后的性能。结果表明，本实验合成的树状多肽的结构和理论产物一致，并且可以载一定量的药物，载药后的颗粒尺寸较小，粒径大小均匀胶束体系的稳定性很好。

关键词：树状多肽 两亲性合成 脱保护 载药

Synthesis and Drug-loading Properties of Amphiphilic Dendritic Polypeptides

Abstract

The main research in this paper is the synthesis of amphiphilic dendritic peptides and their drug-loading properties. The detailed description summarizes the definition and classification of dendritic peptides, the synthesis of dendritic peptides, and the biomedical applications of dendritic peptides in carrying anti-tumor. The main content of the experiment in this paper is the synthesis of fan-shaped dendritic polypeptide. Since the amino group is extremely easy to absorb water, the tail of the synthesized dendritic polypeptide needs to be connected with a hydrophobic tail to facilitate water discharge and enhance structural stability. The synthesized material is then made into micelles for drug loading. The dendritic peptides were characterized after synthesis, and the performance before and after drug loading was compared and analyzed. The results showed that the structure of the dendritic peptide synthesized in this experiment was consistent with the theoretical product, and it could carry a certain amount of drug. The particle size after drug loading was small, and the particle size was uniform and the stability of the micelle system was very good.

Key words: dendritic polypeptide, amphiphilic synthesis, deprotection, drug loading

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 树状大分子及树状多肽的定义 1

1.2 两亲性多肽的定义 1

1.3 树状多肽的合成方法 2

1.3.1 发散法和收敛法 3

1.3.2 液相法和固相法 3

1.4 树状多肽的载药应用 3

1.5 本课题研究内容 4

第二章 实验部分 5

2.1 实验试剂和仪器 5

2.2 实验过程 6

2.2.1 二代树状多肽的合成 6

2.2.2 三代树状多肽的合成 8

2.2.3 四代树状多肽的合成 10

2.2.4 四代树状多肽接疏水尾巴的合成 11

2.2.5 四代树状多肽做成胶束并载药 12

第三章 实验结果与表征 14

3.1 核磁共振分析 14

3.1.1 二代多肽核磁共振分析 14

3.1.2 三代多肽核磁共振分析 16

3.1.3 四代多肽核磁共振分析 18

3.2 粒径和电位的分析 19

3.2.1 粒径分析 19

3.2.2 zeta电位分析 20

3.3 实验结果 22

第四章 总结与展望 23

参考文献 24

致谢 26

第一章 绪论

1.1 树状大分子及树状多肽的定义

近几年，研究人员发现了一种树状的大分子，这是一种的新型功能性材料,它是通过枝化基元反应，然后经过一步一步重复反应得到的，这种材料的内部结构具有高度枝化。早期的树状大分子是1985 年 Tomalia 合成的聚酰胺-胺(PAMAM)系列分子^[1]和 Newkome 的“树状系统”(“arborol”systems)^[1]。前人合成树状多大分子通常使用发散合成法^[1],但是到了1990年， Fréchet 首次系统的介绍了另一种合成方法即收敛法(convergentapproach)^[1], 形成了当代的的两大合成方法。一方面，这种材料的分子量分布的很单一。而且，分子的表面官能团很密集，官能化也极其容易。此外，该材料内部还有极大的空腔,。正是由于树状大分子的这些优越的特性 ,使得它在许多领域有着极大的潜在用途。

如果树状大分子内部结构含有多肽时，这就是我们所谓的树状多肽^{[ 7]}。多肽是一种氨基酸，根据多肽在分子中的存在方式,多肽树枝状大分子可分为两大类^[8]:一种是共价的树状多肽，另一种就是非共价的树状多肽共价多肽。一般来说，在共价树状多肽大分子中^[1], 将氨基酸作为枝化单元, 通过这种方式从而以共价键形式连接在整个体系中。其次，在非共价树状多肽大分子中, 多肽与其它树枝状大分子内核通过氢键或静电作用将两个体系连接在一起^[1]。树状多肽不仅具有普通树状大分子的特点，还具有多肽的一些生物特性。比如说：具有像蛋白质一样的球形结构、在水中的溶解性较好、不易降解、容易被细胞吞噬等等。

1.2 两亲性多肽的定义

所谓两亲性即亲油性和亲水性，而两亲性的多肽的分子结构也是比较的特殊的，它的结构近似于表面活性剂，而多肽用来驱动亲水段和疏水段之间的氢键。自组装形成规则有序的纳米/微米结构。在组装过程中，由于疏水性这一特性，疏水链段会慢慢聚集，从而形成整个组件的疏水核心。因为多肽链中有氢键，氢键作用力使得多肽的亲水片段相互聚集，所以上述部分表面紧密结合，拥有一定的二级结构，并是在与水接触以进一步便于组装完成。两亲性的多肽分子种类在许多情况下，疏水性片段的组成可以分为表面活性剂肽。此外，外部条件的变化对自组装也有一定影响，例如，它会改变非共价键之间的相互作用力，并通过T通过头基之间的静电相互作用，疏水尾部的相互作用和分子间氢键彼此协调，控制两亲性多肽自组装的形貌^[2]。使用扫描电镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）研究了A6K和A9K在AmK系列亲水疏水固/液界面上的吸附行为。在固/液界面上吸附两亲性多肽，推测在亲水界面处，静电相互作用引发吸附行为，并且疏水相互作用在平衡中起主要作用；在疏水界面处，初始阶段和平衡状态下的疏水相互作用起着主导作用。

表面活性肽的疏水链段通常由多个连续的疏水氨基酸残基组成，亲水片段含有一个或两个带有一个或两个正电荷或负电荷的氨基酸残基，天然磷脂和这种链段的内部结构非常相似^[3]。Zhang 等设计并合成一系列小分子表面活性肽^[3]。研究人员对多肽的结构进行优化，发现以磷酸化的Ser为亲水链段,当A6或V6是疏水链段时, 多肽的组装行为更接近天然磷脂^[6]。当相反的电荷 A6D和A6K混合时,随着 A6D/ A6K 混合摩尔比从1:1增加到2:1，整个组装体从纳米线变为膜结构^[7]。例如，如表面活性肽V6D，A6D，A6D和V6K 可以大大提高膜蛋白的活性和稳定性^[7]，优于传统的表面活性剂N-十二烷基麦芽糖苷和 N-辛基-葡糖苷^{[10 -12]}带有正电荷的表面活性肽也可以用作抗菌药物使用，它可以通过与细菌细胞膜磷脂相互作用破坏细菌的细胞膜构来杀死细菌^[2]。

1.3 树状多肽的合成方法

截止目前，用于合成树状多肽两种主要方法，如前文所述就是发散合成法和收敛合成法。发散法原理就是由核心逐步向末端合成。而敛法的原理是先要合成官能团, 然后纯化他们，最后通过特殊的化学方法连接到树状核心上。这两种方法是当今合成树状多肽的主要方法，对于这一领域的研究扮演者举足轻重的作用，为今后的研究奠定坚实了基础。

1.3.1 发散法和收敛法

发散法是一种直接有效的方法，这种方法从内核开始慢慢地生长，然后逐渐向外扩散，慢慢形成树枝状大分子。收敛方法是间接合成方法,这种方法需要先合成官能团, 并且在纯化后，将它们通过特定的化学方法接在树枝状核心上。发散法的优点是快速有效，现阶段用于合成分子量小并且易分离的树状多肽。如果枝化单元的不能逐步合成，或者聚合物分子不易分离,此方法将不再适用。相反，对于收敛合成法,由于氨基酸在偶联之前已经纯化，因此副反应少，并且反应产物易于纯化。然而，收敛法合成过程比较复杂，比发散法合成有更多的反应步骤,中间产物的每个步骤都需要纯化和表征;此外,当使用受保护的多肽片断时，产生的多肽中间体在水中的溶解性较差,这也是收敛方法中的一大个问题。

1.3.2 液相法和固相法

使用液相法合成聚合物，每一步都要分离副产物，并且将产物进行表征，所以反应容易控制、检测脱保护或偶联反应中的副反应。然而，中间体的分离和表征花费大量的时间，即使合成代数很低的树枝状分子也需投入大量精力^[4]，并且受保护中间体差的溶解性增加了合成的难度。具体的合成步骤与线型多肽相同。通常合成开始于以di Boc或di Fmoc保护的赖氨酸合成二级或三级的分支结构 ,然后其它多肽序列被一步一步合成到该赖氨酸骨架上^[5]。然而,固相合成中的中间产物不能被纯化和表征，仅在反应完成后，将最终的产物从树脂上切下，然后纯化和表征。在最终产物的纯化中，由于产物中存在与目标分子结构相似的有缺陷的分子，导致最终分离和纯化的难度增加。

1.4 树状多肽的载药应用

Porter ^[6]等研究人员合成了一种新型的树枝状分子，这种大分子被PEG(1100)修饰。通过偶联反应，将pH 敏感药物接到到树状多肽上。结果显示，经过PEG修饰的树状多肽变得更加不稳定。此外，研究人员在动物体内实验，实验结果表明：被PEG修饰的第五代赖氨酸大分子其载药量在器官中非常大。这表明经过PEG化的赖氨酸具有对肿瘤细胞的靶向功能。研究人员又对PEG化的赖氨酸和PEG化的脂质体作为DOX的传递系统进行探索性研究，分别研究了整个系统的毒性大小、药物抗肿瘤的活性以及药物代谢动力学^[7]。结果表明，上述被修饰的的阿霉素都可以抑制肿瘤细胞的生长和以及其在细胞中的扩散。并且这种被修饰的赖氨酸在人体细胞中的毒性较低。这些结果都说明PEG化的树状多肽是一类优越的新型材料，未来在抗肿瘤药物载体方面很有作用^[10]。

1.5 本课题研究内容

本实验主要研究的是两亲性树状多肽的合成，并且对树状多肽进行载药实验，系统的表征树状多肽的理化特性，包括粒径、粒径分布、电位等。希望以此构建一种药物输送系统，对肿瘤的靶向治疗提供重要输送媒介。

第二章 实验部分

2.1 实验试剂和仪器

表2-1

表2-2

2.2 实验过程

2.2.1 二代树状多肽的合成

二代分子结构式如下

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