摘 要

采用水提醇沉法提取菝葜粗多糖，粗多糖经过反复醇沉、冻融，透析后得到菝葜多糖SCP。设计三种抗氧化体系，以VC为阳性对照，探究菝葜多糖抗氧化活性。结果：粗多糖提取率为2.4%，糖含量为58.88%；粗多糖纯化得到的菝葜多糖产率为6.17%，糖含量为54.42%，糖醛酸含量43.45%；纯化后的菝葜多糖在三种抗氧化体系中均表现出较强的自由基清除能力。本研究确立了一套优良的菝葜多糖提取、分离纯化方法，并得到了纯化的菝葜，通过自由基清除实验验证了菝葜多糖的体外抗氧化活性。

关键词：菝葜多糖；提取；纯化；抗氧化活性

Abstract

By water extraction、 freezing and alcohol precipitation we obtained the Smilax china crude, polysaccharide by water extraction、freezing and alcohol precipitation; Crude polysaccharide was isolated and purified,we got the purified polysaccharide from the Smilax china L. The crude polysaccharide’s extraction rate is 2.4%, and the crude polysaccharide’s sugar content is 58.88%; The purified Smilax china polysaccharide’s yield is 6.17%, the crude polysaccharide’s sugar content is 54.42%，the uronic acid content is 43.45%; The purified polysaccharide from the Smilax china L showed strong free radical scavenging ability in all three antioxidant systems. So a more integrated method for Smilax china polysaccharide was established; the purified Smilax china polysaccharide was obtained, antioxidant activity of SCP was confirmed.

Key Words: Smilax china L.; polysaccharide; Extraction ; purification; Antioxidant activity

目 录

第1章 绪论 1

第2章 菝葜多糖提取工艺研究 4

2.1 实验方法 4

2.1.1 菝葜粗多糖提取工艺 4

2.1.2 菝葜粗多糖提取率的计算 4

2.1.3 糖含量的测定 4

2.1.3.1 苯酚-硫酸法测葡萄糖标准曲线 5

2.1.3.2 样品糖含量的测定 6

2.2 结果与分析 6

2.2.1 粗多糖的提取率与糖含量 6

第3章 菝葜多糖分离纯化工艺研究 8

3.1 实验材料和仪器 8

3.2 实验方法 9

3.2.1 反复醇沉 10

3.2.2 反复冻融法 10

3.2.3 透析 10

3.2.4 苯酚-硫酸法糖含量 11

3.2.5 间羟基联苯法测糖醛酸含量 11

3.2.5.1 标准曲线的制作 12

3.2.5.2 样品糖醛酸含量的测定 12

3.3 结果与分析 14

第4章 抗氧化活性研究 14

4.1 实验材料和仪器 14

4.2 实验方法 14

4.2.1 DPPH自由基清除实验 14

4.2.2 超氧阴离子自由基清除实验 15

4.2.3 羟基自由基清除实验 16

4.3 实验结果 16

4.3.1 菝葜多糖对DPPH自由基清除实验结果 16

4.3.2 菝葜多糖对超氧阴离子自由基清除实验结果 17

4.3.3 菝葜多糖对羟基自由基清除实验结果 18

4.4 讨论与结论 18

5 研究总结 20

参考文献 21

致 谢 23

第一章 绪论

提取多糖的方法通常有水提醇沉、酸提、碱提等，大多数多糖的水溶性较大，因此本研究选择以水为溶剂提取多糖。在提取前采用乙醇浸泡药材，以除去部分脂溶性杂质。并且将浸泡后的植物药材粉碎，增加与提取溶剂接触面积，提高提取率，提取时选择适宜的料液比，反复提取几次后的水提液浓缩后经醇沉、冻融、干燥即得到粗多糖。高纯度多糖是多糖结构及药理活性研究的基础，因此分离纯化方法是多糖研究中的重点内容。通常经水提醇沉方法得到的多糖含有的杂质一般为色素、蛋白质、寡糖和单糖等。多糖的分离纯化主要包括以下两个方面，除去多糖中含有杂质并纯化以得到高纯度的均一多糖。本次课题中采取的粗多糖的分离纯化方法为首先冻融脱蛋白、经透析除质、48h冻干后即得多糖。由于本次课题主要探究其抗氧化活性是否与多糖有关，故在实验中并未将多糖进行分级纯化。值得注意的是，分离纯化的方法并不一定适合所有的多糖，因此前期需要做大量的实验寻求最佳提取方法。

菝葜又名金刚藤，生于海拔2000米以下的林下、灌丛中、路旁、河谷或山坡上，主要分布于中国西南、中南及华东等地区。菝葜在临床上具有广泛的应用，尤其是用于治疗慢性盆腔炎等慢性妇科疾病。在近年来的研究中已经证明菝葜具有抗炎、抗肿瘤、镇痛、免疫抑制及抗氧化等药理活性，近年来对于菝葜的化学成分已有一些研究报道，主要成分见下表1.1，其中对于甾体皂苷类、黄酮及其苷类这两种成分的研究最多，但是当前的研究对于其中发挥各种药理活性和作用机制的物质基础并未进行深入研究，并且目前也没有关于菝葜多糖的文献，所以我们打算以菝葜多糖为研究对象探究其药理活性。

当前菝葜在市场上的流通商品为金刚藤糖浆，是由菝葜单味药材所制。因为其具有药效良，且中药制剂毒副作用低，故而是临床上常用于治疗慢性妇科炎症的药物。但是并未指出发挥药效主要物质，对我们之后的研究造成一定的影响。

表1.1 菝葜中的主要化学成分

目前菝葜的各种药理活性逐渐被证实，通过对炎症动物的治疗实验舒孝顺等^[12]发现菝葜具有抗炎作用；通过体内外的免疫实验舒孝顺^[13]证实了菝葜具有免疫调节作用；通过镇痛试验发现具有镇痛功效^[14]；王涛^[16]以感染小鼠为模型证明了菝葜的抗菌作用；杨华山^[17]，邱千^[18]发现了菝葜的体外抗肿瘤活性；沈明^[19]证实了其降血糖活性；通过自由基清除实验赵钟祥^[20]发现了其内含有抗氧化成分；同时也可以治疗佐剂性关节炎^[21]。

经现代医学研究表明，体内过多的自由基可加速机体衰老及诱发各类疾病。目前所开发的抗氧化剂虽然能有效清除体内自由基，但在研究过程中发现这些抗氧化剂的过量使用对人体健康造成了不利影响。因此开发安全、高效的抗氧化剂是研究的重点内容。目前，有许多的植物提取物被证明有抗氧化活性，并且在清除自由基的同时多数还具有吸收放射性物质，保护器官免受损伤的作用，是具有良好开发应用前景的抗氧化剂。

在之前的研究中已经发现菝葜的甲醇、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物均能有效清除DPPH自由基^[22]。但并未明确指出菝葜中的某种组分含有抗氧化活性，本次实验以水为提取剂，采用水提醇沉的方法提取得到菝葜粗多糖，经分离纯化得到纯化的菝葜多糖，验证其是否具有抗氧化活性。本次研究的抗氧化体系有三种，分别为 DPPH 自由基清除体系、超氧阴离子自由基清除体系和羟基自由基清除体系，为之后开发菝葜多糖作为抗氧化剂提供理论基础。

本研究主要探究菝葜多糖是否具有抗氧化活性，探究其抗氧化能力的大小。目前的研究任务为：通过适宜的提取分离纯化方法从干燥的菝葜根茎中得到纯化的菝葜多糖，再进行抗氧化活性实验。

课题研究内容有如下几方面：

1. 提取工艺：水提醇沉法得到菝葜粗多糖；
2. 纯化工艺：两次醇沉、四次冻融、透析及冻干得到纯化的菝葜粗多糖；
3. 苯酚-硫酸法测定糖含量及间羟基联苯法测定糖醛酸含量。
4. 测定菝葜多糖清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基及羟基自由基的能力。

第二章 菝葜多糖提取工艺研究

2.1 实验方法

2.1.1 菝葜粗多糖提取工艺

菝葜粗多糖的提取工艺为：将干燥的菝葜根茎准确称重浓度为95%的乙醇浸泡一整晚后，倒掉乙醇后清洗药材，直至没有明显的乙醇味后，将药材先用刀剁成小款，然后放入摇摆式万能粉碎机中粉碎，菝葜粉末用纯化水浸泡一整晚后进行三次提取，合并三次的水提液，浓缩至450mL左右去离心除去不溶物，浓缩液冻融，再一次离心除去不溶物，上清液中加入三倍量的95%乙醇沉淀，静置一整晚，去离心，将沉淀烘干后就可以得到菝葜粗多糖。

药材预处理：分别称取两份200g干燥菝葜根茎，加入95%乙醇浸泡放置一整晚，倾去乙醇后清洗菝葜根茎至无明显乙醇味后用刀将碎，然后放入电动式万能粉碎机中粉碎20s，收集菝葜粉末留用。

水提：将菝葜粉末均分成四份留用（相当于干燥菝葜根茎100g），每份菝葜粉末提前加入1000ml水浸泡12h，有利于水分充分进入植物细胞，提高多糖的提取率。之后补加1.5L水，保持加热器功率为800W，提取3h，将得到的菝葜提取液离心（4000r/min，3min），离心后的液体由纱布过滤，残渣收集起来进入下一轮提取，共提取三次。合并三次提取液，浓缩至450ml左右，待浓缩液冷却后放入冰箱4℃过夜。提取液呈红棕色，浓缩过程中有沉淀析出，放冷后浓缩液变为红棕色果冻状。

冻融：离心（4000r/min，15min）浓缩液，并将上清液倒入烧杯中，在冰箱-20℃下放置，冷冻一夜后取出解冻。解冻时伴随大量红棕色絮状沉淀出现。

醇沉：待冷冻液融化完全后，去离心（7500r/min，10min），上清液于激烈搅拌下加入三倍95%乙醇，4℃静置过夜后，倾去上清液后离心，将离心所得沉淀于60℃烘箱中烘干，干燥约24h后取出，研磨后得到菝葜粗多糖（菝葜粗多糖呈浅红棕色）。

2.1.2 菝葜粗多糖提取率的计算

公式如下：

菝葜粗多糖提取率= （2.1）

其中，x为每批所获得的多糖质量（g）；M为批提取菝葜原料质量（g）。

2.1.3 糖含量的测定

本研究中采用了苯酚-硫酸法^[23]测量菝葜粗多糖中的糖含量。

2.1.3.1 苯酚-硫酸法测量糖含量的标准曲线

配制葡萄糖标准溶液：首先精密称取100mg葡萄糖标准品，再加入大约40ml蒸馏水溶解后，将其中的溶液移至容量为100mL的容量瓶中，定容并摇晃均匀，准确吸取10mL加入另一个容量为100mL的容量瓶中，再次定容并摇晃均匀，这样就可到浓度为100µg/mL葡萄糖溶液留用。

配制5%苯酚：纯度为100%的苯酚在室温下不为液体状态，因此使用前要用水浴加热使苯酚融化成液体才能用于溶液配制，首先在一避光的瓶中加蒸馏水45g，准确吸取2.5g预前融化好的液态苯酚用移液枪注入，之后补蒸馏水至重量为50g，采用超声使苯酚溶解溶液浓度均一，这样就可以得到浓度为5%的苯酚溶液，遮光储存留用。