论文总字数：28549字

摘 要

氧化还原酶作为酶的六大类型之一在催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等重要化工原料及医药中间体方面显示了极大的优势，受到研究者的广泛青睐。然而反应过程需要消耗昂贵的与产物同样化学当量的辅酶，由此辅酶的原位再生技术成为了限制氧化还原酶工业化应用的瓶颈。在酶法辅酶再生系统中，NADH氧化酶因其催化反应不可逆，产物结构简单，对主产物分离纯化无影响的优点，在氧化型辅酶NAD 再生中表现出了巨大的应用潜力。

为了高效地获得一个H₂O型NADH氧化酶，本研究通过数据挖掘的方式快速扩增了Streptococcus thermophiles中拥有自主知识产权的新型NADH氧化酶StNox。在大肠杆菌中成功表达后对底物NADH的活性为27.2 U/mg protein。StNox的酶学性质表明：仅氧化NADH的StNox对其最大反应速率为8.80 mmol·L^-1·min^-1，Km 值为70 μmol·L^-1，最适反应pH 7.0，最适反应温度为55 ºC，Gu2 对StNox的活性有很强的抑制作用，其他的一些金属离子如Ba² 、Mn² 、K 、Li 、Na 、Zn² 、 Mg² 以及螯合剂EDTA对酶的活性基本没有影响。最后对StNox在辅酶再生领域的应用进行了初步的探索，5小时内250 mmol·L^-1底物D-山梨醇完全转化为D-果糖。

关键词：NADH 氧化酶 克隆表达 NAD 再生 酶学性质

ABSTRACT

Oxidoreductase as one of the six types of enzyme played an important role in catalytic preparation of chiral alcohols, hydroxy acids, amino acids and other important chemical raw materials and pharmaceutical intermediates. However, the reactions carried by oxidoreductases need to consume expensive coenzyme of the same chemical equivalent, therefor situ regeneration technology has become the bottleneck of the restrictions in oxidoreductase industrialized application. Among all enzymatic coenzyme regeneration systems, NADH oxidase, product structure is simple, the main product purification the advantages of no effect on the oxidation type coenzymes NAD regeneration showed great potential applications.

In order to efficiently obtain a H2O NADH oxidase, this study rapid amplification by means of data mining for Streptococcus thermophiles in new StNox NADH oxidase with independent intellectual property rights. After successfully expressed in e. coli to the activity of the substrate NADH is 27.2 U/mg protein. StNox enzymology properties showed that the oxidation of NADH StNox only to its maximum reaction rate of 8.80 mmol·L-1·min-1, the Km value is 70μmol·L-1 , the optimal reaction pH 7.0, the optimum reaction temperature for 55 C, DHS Gu2 activity has a strong inhibitory effect of StNox, other metal ions such as Ba2 、Mn2 、K 、Li 、Na 、Zn2 、 Mg2 , and chelator EDTA has no effect on enzyme activity of basic. On the applications of co-enzyme regeneration StNox has carried on the preliminary exploration, 250 mmol·L-1 D - sorbitol completely into D – fructose in 5 hours.

KEYWORDS: NADH oxidase , cloning and expression , Regeneration of NAD enzymatic property

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1 NADH氧化酶的分类、来源及结构 1

1.2 NADH氧化酶的理化性质 3

1.2.1 最适pH值及pH稳定性 3

1.2.2 最适温度及热稳定性 3

1.2.3 NADH氧化酶的底物偏好 3

1.3 NADH氧化酶的作用机理 4

1.3.1 NADH氧化酶的辅因子 4

1.3.2 NADH氧化酶的作用机理 4

1.4 NADH氧化酶分离纯化研究 5

1.5 NADH氧化酶的应用进展 6

1.5.1 辅酶再生 6

1.5.2 人工调节NOX酶活，调控胞内代谢通路 7

1.6 本课题的立题背景、意义及研究内容 7

第二章 材料与方法 8

2.1 实验材料实验仪器 8

2.1.1 实验试剂 8

2.1.2 菌株、质粒、工具酶、分子量标准和试剂盒 9

2.1.3 培养基 10

2.2 实验方法 11

2.2.1 NADH氧化酶基因nox在大肠杆菌中的克隆和表达 11

2.2.2 重组NADH氧化酶的纯化 12

2.2.3 重组NADH氧化酶的生化性质研究 13

2.2.4 NADH氧化酶在辅酶再生体系中的应用 14

第三章 结果与讨论 15

3.1 序列挖掘获得NADH氧化酶StNox 15

3.2 StNox基因nox的克隆和表达 15

3.2.1 嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）基因组的提取 15

3.2.2 目的基因的获取及重组菌的构建 15

3.2.3 氨基酸序列分析 16

3.2.4 pET-28a-nox的表达和酶活性分析 18

3.3 重组StNox的纯化 18

3.4 酶学性质的研究 19

3.4.1 pH对StNox活性和稳定性的影响 19

3.4.2 温度对StNox活性和稳定性的影响 20

3.4.3 StNox还原产物确定、辅酶依赖性及动力学参数 21

3.4.4 化学试剂对StNox的影响 22

3.4.5 几种H₂O型NADH氧化酶的酶学性质的比较 23

3.5 双酶耦合体系催化D-山梨醇生成D-果糖 24

第四章 结论与展望 25

4.1 结论 25

4.2 展望 25

参考文献 26

致 谢 29

文献综述

近年来，随着氧化还原酶在催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等方面发挥越来越重要的作用，在制药、食品、精细化工、农药等领域均表现出广泛的用途，对这种类型酶的研究也愈发受到人们的重视。氧化还原酶在进行生物催化反应的同时，需要消耗一定量的辅酶，大约80%的氧化还原酶的辅酶为尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD /NADH)，导致这类辅酶的在工业、科研上的需求也随之剧增。然而，辅酶的价格昂贵，甚至比酶促反应所得产物的价格还要高，而重复利用性和稳定性却很低。NADH氧化酶是一类催化NADH氧化为NAD 并消耗氧气的氧化还原酶，由于其反应物氧气不需另行加入，产物结构简单，对主产物分离纯化无影响的优点，在氧化型辅酶NAD 再生以及人工调控微生物代谢流向中表现出了巨大的应用潜力。NADH氧化酶也是细胞中重要的氧代谢酶，它能够清除细胞内氧毒性，帮助细胞抗击外界氧压力，对于维持胞内氧平衡具有重要意义。

NADH氧化酶的分类、来源及结构

NADH氧化酶(NADH oxidase，NOX，EC 1.6.99.3)是一种能催化NADH氧化的氧化还原酶，在O₂存在的条件下，该酶催化NADH氧化为NAD ，同时O₂还原为H₂O或H₂O₂，反应过程如图1所示。根据O₂还原后产物的不同，NOX可分为两类：一类还原为H₂O₂，反应过程产生2个电子的转移，称之为NADH过氧化酶或H₂O₂型NADH氧化酶(NOX-1) ^[1]；另一类还原为H₂O，反应过程产生4个电子的转移，即狭义的NADH氧化酶，也称为H₂O型NADH氧化酶(NOX-2) ^[2]。除此之外，也有人将NOX分为3类，除去上述两类，还有一类其产物为O₂^-，其在生成O₂^-的过程中有1个电子发生转移^[3].

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