论文总字数：14817字

摘 要

木聚糖酶是木聚糖降解中的关键酶，在自然界中分布广泛，其对水解植物纤维原料中的半纤维素有着重要作用，目前已在许多领域，如造纸、能源、食品、材料、医药等领域得到广泛应用。相比于传统的真菌产木聚糖酶，目前研究的重是耐热耐碱特性的木聚糖酶。

本论文以实验室构建的基因工程菌Rosetta（DE3）28a-xynB作为出发菌株，对该菌的发酵产酶条件进行了研究；当以在以IPTG为诱导剂时，木聚糖酶的活力最高可达 ---11000U/mL；而以乳糖为诱导剂时，酶活力可达-----9600U/mL。当以乳清粉为诱导剂时，酶活力也可达8700U/mL.因此考虑到添加成本及诱导效果，在工业化生产中乳糖更适合作为诱导剂。

关键词：木聚糖酶 培养优化 诱导

Studies on fermentation of xylanase by

Recombinant

ABSTRACT

Xylanase is an important enzyme of glyco-hydrolases, which can hydrolyze the hemicelluloses of plant wall. So it can be widely used in paper Industry, energy, food and material industries.

Study on the cultivating conditions and medium of recombinant Rosetta（DE3）28a-xynB stain were performed in this dissertation. When using IPTG as the inducer, the maximum activity of xylanase could reach 11000U/mL , while lactose could reach 9600U/ml. and whey was also considered as the inducer. Therefore ,considering the cost and the effects of inducing ，lactose used as an inducer was better than IPTG in industry application.

Key Words: xylanase; Fermentation optimize; induce

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1木聚糖 1

1.2 木聚糖酶 1

1.2.1木聚糖酶的介绍 1

1.2.2 木聚糖酶的生产 2

1.2.3 木聚糖酶的应用 3

1.3 目前研究的问题 4

1.3.1 木聚糖酶的作用温度 4

1.3.2 木聚糖酶作用的pH值 4

1.3.3 木聚糖酶的活性和产量 5

1.4 木聚糖酶的性质 5

1.5 正交实验法 6

1.6 本课题的研究目的及主要内容 6

第二章 实验材料与方法 7

2.1 引言 7

2.2 实验材料 7

2.2.1 菌种 7

2.2.2 培养基 7

2.2.3 主要仪器设备 7

2.2.4 主要试剂及原料 8

2.3 实验方法 8

2.3.1 种子液的制备 8

2.3.2 液体产酶 8

2.3.3 菌体生长曲线 8

2.3.4 分析测定方法： 8

2.3.5 正交试验确定最佳诱导条件 9

2.3.6最佳诱导条件的验证 10

第三章 实验结果与讨论 11

3.1菌体生长曲线的绘制 11

3.2木糖标准曲线的测定 11

3.3最佳诱导条件的确定 12

3.3.1 IPTG诱导 12

3.3.2 乳糖诱导 15

第四章 结论与展望 19

1.结论 19

2.展望 19

参考文献 20

致 谢 22

第一章 文献综述

1.1 木聚糖和木聚糖酶

木聚糖是植物半纤维素的重要的组分之一，其在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，约占植物细胞干重的15~35%。在常见的农业副产物如米糠、麦麸、玉米芯、秸秆、蔗渣中都含有丰富的木聚糖成分。

木聚糖作为杂合多聚分子，其主链上则是由多个β-D-吡喃木糖残基通过4-糖苷键，β-1，或者β-1，3-糖苷键相连，前一种存在于陆生植物细胞壁中，后者则存在于海洋藻类的细胞壁中；侧链上多连着取代基4-O-甲基-D葡糖醛酸残基、L-阿拉伯糖残基、O-乙酰基等。主要结构特征如图1-1^[1]。

图1-1 木聚糖的结构

Fig. 1-1 Chemical structure of xylan

由于木聚糖的结构相对复杂，它的完全降解需要多种酶联合作用（见表1-1），其中木聚糖酶（EC.3.2.1.8）可以内切的方式作用于由木聚糖主链分解而产生的不同长度的低聚木糖和少量的木单糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶^[2]。

表1-1 木聚糖降解酶系

Table 1-1 Enzyme system of xylanolytic

木聚糖酶在自然界中广泛分布，如动植物组织和器官及多种微生物中都存在木聚糖酶，目前研究较多的是利用微生物，如真菌产生的木聚糖酶。作为木聚糖水解酶系中最关键的水解酶，木聚糖酶主要通过水解木糖分子的β-1，4-糖苷键，将木聚糖水解为低聚木糖，及少量的木单糖和微量阿拉伯糖。在造纸工业上用木聚糖酶处理硫酸盐纸浆可减少后续漂白处理过程中化学剂的用量，此外木聚糖豆酶也可加入饲料添加剂中以提高饲料的能量值，利于畜禽增殖肠道内的双歧杆菌，还可用于食品改良剂和酿酒等方面。因此研究者们集中对木聚糖酶的分子结构、性质、最佳作用条件及其在各领域的应用进行了大量深入的研究。根据催化结构域的氨基酸组成分析可知，大部分木聚糖酶属于G/11和F/10两大家族。G/11多为单结构域类型，相对分子质量一般小于30,000，产物中寡聚糖含量较多，而单糖成分相对较少，酶的最适作用温度为50~60℃。而F/10族的木聚糖酶则含有较多结构域，如催化结构域以及纤维素结合结构域等等，其相对分子质量一般大于30,000，而催化产物中以单糖为主，最适作用温度为60~80℃，因此，与G/11族相比，F/10族的木聚糖酶在耐高温、耐酸碱性方面更有优势^[3]。

1.2 木聚糖酶的应用

1.2.1 在造纸工业中的应用

传统的造纸工业中一般使用氯气、二氧化氯等物质来去除会引起纸浆变为褐色的木质素，导致了造纸废水含有多种有害物质。1986年，Viikari首次提出用半纤维素酶处理来纸浆，可以大大减少后续的漂白过程中氯的使用量，木聚糖酶开始被广泛地应用到漂白纸浆工艺中^{[4, 5]}，利用此法，可以减少有毒的化学物质的使用量、缩短处理时间。通常情况下，纸浆漂白的环境为温度较高的偏碱性环境，因此这就需要所用木聚糖酶具备较强的耐热性和耐碱性，海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8极耐热木聚糖酶B在100 ℃内、pH6.5～8.5范围内都很稳定，因此有着较大的工业化应用潜力^[6] 。

1.2.2 在食品行业中的应用

1.2.2.1低聚木糖

低聚木糖是一种功能性低聚糖，有明显的双歧杆菌增殖作用，其中木二糖不会被消化酶水解，肠道残存率高，产生的有机酸能降低肠道pH，抑制肠道腐败物质，其选择利用性高于其他功能性低聚糖；因其难发酵，也不像葡萄糖、果糖、半乳糖等易造成龋齿；食用后代谢不依赖胰岛素，不会使血糖升高，适合作为糖尿病患者的代糖品，低聚木糖的生产依赖于木聚糖酶的作用，其中海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8极耐热木聚糖酶B具有较大的应用潜力^[7-9]。

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